Souris C57BL / 6 ont été utilisés pour étudier la pathogenèse Hc et de fournir le meilleur modèle. Nous explorons les avantages potentiels de l'immunité humorale contre ce champignon et a généré plusieurs anticorps monoclonaux [à histone H2B et une protéine de choc thermique 60kDa] que nous avons testés pour leur efficacité protectrice après l'administration par voie intrapéritonéale.
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Article de méthode
L'administration passive d'anticorps monoclonaux contre H. capsulatum Et autres pathogènes fongiques
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le but de l'utilisation de cette méthodologie est 1) pour faire progresser notre capacité de protéger les individus avec un anticorps ou un vaccin pour prévenir ou traiter l'histoplasmose causée par le champignon Histoplasma capsulatum et 2) d'examiner le rôle des facteurs de virulence comme cible pour la thérapie. Pour générer des AcM, les souris sont immunisées, les réponses immunitaires sont évalués en utilisant une phase solide système ELISA développée dans notre laboratoire, et la meilleure souris répondeur sont sélectionnés pour l'isolement de splénocytes pour la fusion avec des cellules d'hybridome. Souris C57BL / 6 ont été largement utilisées pour étudier H. pathogenèse capsulatum et de fournir le meilleur modèle pour obtenir les données requises. Afin d'évaluer le rôle des anticorps monoclonaux dans l'infection des souris par voie intrapéritonéale sont administrés avec soit mAb à H. capsulatum ou isotype témoin apparié mAb puis infectées soit par voie intraveineuse (iv), intrapéritonéale (ip) ou intranasale (in) itinéraires. Dans la littérature scientifique, l'efficacité des anticorps monoclonaux pour des infections fongiques chez la souris repose sur la mortalité comme un point final, en collaboration avec les unités formin colonie (UFC) des évaluations à des moments plus tôt. Survie (le temps de la mort) des études sont nécessaires car ils représentent le mieux la maladie humaine. Ainsi, l'efficacité de notre intervention ne serait pas suffisamment établie sans courbes de survie. Cela est également vrai pour établir l'efficacité du vaccin ou des tests de mutants de virulence. Avec l'histoplasmose, les souris vont souvent d'être énergique pour morte pendant plusieurs heures. La capacité d'une intervention telle que l'administration d'un anticorps monoclonal peut d'abord protéger un animal de la maladie, mais la maladie peut rechutes qui ne serait pas réalisé dans les expériences de courte UFC. En plus de la survie et des dosages charge fongique, nous examinons les réponses inflammatoires à l'infection (histologie, le recrutement cellulaire, les cytokines). Pour la survie / heure aux expériences de mort, les souris sont infectées et surveillées au moins deux fois par jour pour des signes de morbidité. Afin d'évaluer la charge fongique, l'histopathologie, et les réponses des cytokines, les souris sont euthanasiées à divers moments après l'infection. Les expérimentations animales sont réalisées selon les directives de l'Institut d'études des animaux de l'Albert Einstein College of Medicine.
Protocole
1. La croissance de H. Capsulatum
- Préparer une enceinte de sécurité biologique pour le travail avec le champignon par le nettoyage de l'armoire avec l'eau de Javel à 10% puis 20 min d'irradiation UV. H. capsulatum dans la phase de la levure nécessite du niveau de biosécurité (BSL) pratiques II, tandis que la forme du moule nécessite BSLIII. Utilisez la forme levure dans les étapes suivantes.
- Suivant préparer un tube de 15 ml conique avec 5 ml de PBS. Récolte d'une colonie de H. capsulatum (Hc souche ATCC G217B) à partir d'une plaque de BHI agar au sang [de glucose à 10 g / L, la cystéine 0,1 g / L, la p....
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Discussion
Le protocole présenté ici démontre que MAB à H. capsulatum peut modifier le cours de l'histoplasmose expérimental murin. MAbs d'antigènes de surface cellulaire des pathogènes peuvent modifier la dynamique complexe qui se produisent lors de l'interaction entre un hôte et un agent pathogène. Cette étude établit que mAb intervenir dans la protection dans un modèle murin de l'histoplasmose mortelles lorsqu'elles sont injectées par voie intrapéritonéale, et il suggère protéines candidates pour le.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom de la Matière | Société | ||
| Enceinte de sécurité biologique (BSL2) | |||
| 15 ml tubes coniques | Falcon, BD | ||
| HAM F-12 moyennes | Gibco | ||
| 37 ° C agitateur | |||
| Vortex | |||
| 50 ml tubes coniques | Falcon, BD | ||
| 26G1 / 2 aiguilles | BD | ||
| Seringue de 10 ml | BD | ||
| Flacons de 250 ml | |||
| FPLC (Fast chromatographie liquide protéines) du système | GE Helthcare | ||
| Lecteur ELISA | BioTek | ||
| Anesthésie (kétamine et xylazine) | |||
| Colonne stands | |||
| Cordes nylon | |||
| Lampe chauffante | |||
| Crépines cellules 70μm | Falcon, BD | ||
| Gélose BHI | Gibco |
Références
- Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide. J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).
- Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. Monoclon....
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Réimpressions et autorisations
