Méthodes pour l'imagerie par bioluminescence des infections bactériennes chez les animaux vivants sont décrits. Les agents pathogènes sont modifiées pour exprimer la luciférase permettant d'imagerie optique du corps entier des infections chez les animaux vivants. Les modèles animaux peuvent être infectés par des pathogènes exprimer la luciférase et le cours résultant de la maladie de visualiser en temps réel par imagerie par bioluminescence.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
En utilisant la luciférase aux infections bactériennes chez les souris image
Dans cet article
Résumé
Résumé
L'imagerie est une technique intéressante qui peut être utilisé pour surveiller les processus biologiques. En particulier, la présence de cellules cancéreuses, cellules souches, des types spécifiques de cellules immunitaires, des agents pathogènes viraux, les parasites et les bactéries peuvent être suivies en temps réel au sein des animaux vivants, 1-2. Application de l'imagerie par bioluminescence à l'étude des agents pathogènes présente des avantages par rapport aux stratégies classiques en matière d'analyse des infections dans les modèles animaux 3-4. Les infections peuvent être visualisés dans les animaux individuels au fil du temps, sans exiger l'euthanasie afin de déterminer l'emplacement et la quantité de l'agent pathogène. L'imagerie optique permet un examen complet de tous les tissus et organes, plutôt que de l'échantillonnage de sites déjà connus pour être infectés. En outre, la précision de l'inoculation dans des tissus spécifiques peuvent être directement déterminés avant le transport des animaux vers l'avant qui ont été inoculés sans succès à travers toute l'expérience. La variabilité entre les animaux peuvent être contrôlés, puisque l'imagerie permet à chaque animal à être suivis individuellement. Imaging a le potentiel de réduire considérablement le nombre d'animaux nécessaires en raison de la capacité d'obtenir des données à partir de points de temps de nombreux tissus sans avoir à l'échantillon pour déterminer la charge pathogène 3-4.
Ce protocole décrit les méthodes pour visualiser les infections chez les animaux vivants en utilisant l'imagerie par bioluminescence pour les souches recombinantes de bactéries exprimant la luciférase. Le taupin (CBRLuc) et luciférases luciole (FFluc) utilisent comme substrat luciférine 5-6. La lumière produite par les deux CBRluc et FFluc a une longueur d'onde large de 500 nm à 700 nm, ce qui rend ces journalistes luciférases excellent pour l'imagerie optique dans des modèles animaux qui vivent 7-9. C'est principalement parce que les longueurs d'onde de la lumière est supérieure à 600 nm sont nécessaires pour éviter l'absorption par l'hémoglobine et, par conséquent, les voyages à travers les tissus des mammifères de façon efficace. Luciférase est génétiquement introduits dans les bactéries pour produire des signaux de lumière 10. Les souris sont inoculées avec pulmonaires bactéries bioluminescentes intratrachéale pour permettre la surveillance des infections en temps réel. Après l'injection luciférine, les images sont acquises à l'aide du système d'imagerie IVIS. Lors d'imagerie, les souris sont anesthésiés à l'isoflurane utilisant une XGI-8 Gaz Anethesia système. Les images peuvent être analysées pour localiser et quantifier la source du signal, ce qui représente le site de l'infection bactérienne (s) et le nombre, respectivement. Après l'imagerie, la détermination UFC est effectué sur le tissu homogénéisé afin de confirmer la présence de bactéries. Plusieurs doses de bactéries sont utilisées pour corréler le nombre de bactéries à luminescence. Imaging peut être appliquée à l'étude de la pathogenèse et l'évaluation de l'efficacité des composés antibactériens et des vaccins.
Protocole
1. L'infection pulmonaire par intubation intratrachéale
- Peser les souris et, éventuellement, des marques peuvent être faites sur les oreilles pour une identification facile.
- Anesthésier la souris avec la kétamine (100 pg par gramme de poids de la souris) et de xylazine (10 ug par g de poids de la souris) par inoculation intrapéritonéale.
- Placez la souris dans des cages jusqu'à totalement anesthésiée. Pressez les coussinets de leurs pieds pour vérifier la pédale réflexe. Souris devrait afficher réduite ou pas de réaction réflexe.
- Placez la souris sur le stand de l'intubation couché sur le dos.
- Fixer un élastique pour ....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Bien que suivant ces protocoles seront généralement lieu à des images de haute qualité, il est important de considérer quelques questions clés en vue d'obtenir des données précises et cohérentes à partir d'études d'imagerie. Luminescence des images doivent être acquises qui ont compte de 600 à 60 000 pour s'assurer que le signal est au-dessus de fond et la caméra n'est pas saturé. Si le signal obtenu est inférieur à 600 les conditions d'exposition devraient être ajustées pour augmenter les taux. .......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les études animales ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation de la Texas A & M University.
Remerciements
Les auteurs remercient les membres du laboratoire pour les discussions Cirillo et une aide précieuse tout au long de cette étude. Nous remercions le Dr Joshua Hill et le laboratoire du Dr James Samuel de l'aide pour le tournage de ce protocole. Ce travail a été financé par la subvention 48 523 de la Bill & Melinda Gates Foundation et accorder AI47866 du National Institutes of Health.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Isoflurane | VETONE | 501027 | |
| Kétamine | Butler Animal Health Supply | ||
| Xylazine | MP Biomedicals | 158307 | |
| Luciférine | GMT | LUCK-100 | |
| Solution Fetal plus | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | ||
| Cathéter (22G x 1”) | Terumo Medical Corp. | OX2225CA | |
| Fil-guide | Hallowell EMC | 210A3491 | |
| Octoscope avec spéculum | Hallowell EMC | 000A3748 | |
| Système Xenogen IVIS | Caliper Life Sciences | ||
| Système d'anesthésie gazeuse XGI-8 | Caliper Life Sciences | ||
| Logiciel Living Imaging | Caliper Life Sciences | ||
| Embouts nasaux transparents | Caliper Life Sciences | ||
| Séparateur pare-lumière | Caliper Life Sciences |
Références
- Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).
- Hutchens, M., Luker, G. D.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
