Article de méthode

FISH pour le diagnostic préimplantatoire génétique

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DOI :

10.3791/2570

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23 février 2011

 ,  , 
1Department of Cytogenetics, GSTS-Pathology, Guy’s & St Thomas’ NHS Foundation Trust, Guy’s & St Thomas’ Centre for Preimplantation Genetic Diagnosis

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit la sélection des sondes appropriées pour les mono-cellules de poisson, les techniques de propagation pour les noyaux des blastomères, et l'hybridation in situ et la notation du signal, appliquées au diagnostic génétique pré-implantatoire (DPI) dans un contexte clinique.

Résumé

Diagnostic pré-implantatoire génétique (DPI) est une alternative établie pour le diagnostic prénatal, et implique la sélection pré-implantatoire des embryons à partir d'une cohorte générées par la technologie de reproduction assistée (TRA). Cette sélection peut être nécessaire en raison de maladie familiale monogénique (par exemple la mucoviscidose), ou parce que l'un des partenaires réalise un réarrangement chromosomique (par exemple une translocation réciproque dans les deux sens). Le DPI est disponible pour les couples qui ont déjà eu des enfants affectés et / ou dans le cas des réarrangements chromosomiques, fausses couches à répétition, ou l'infertilité. Les ovocytes aspirés stimulation ovarienne sont fécondés par la suite à l'immersion dans le sperme in vitro (FIV) ou par injection intracytoplasmique d'un spermatozoïde individuel (ICSI). Pré-implantatoire des embryons au stade clivage sont biopsiées, habituellement par le prélèvement d'une cellule unique sur 3 jours après la fécondation, et la cellule de biopsie est testé pour établir le statut génétique de l'embryon. L'hybridation fluorescente in situ (FISH) sur les noyaux de cellules fixes biopsiés avec la cible spécifique des sondes d'ADN est la technique de choix pour détecter les déséquilibres chromosomiques associées à des réarrangements chromosomiques, et de sélectionner les embryons féminins dans les familles avec des maladies liées à l'X pour lesquels il n'existe aucune mutation spécifique de test. FISH a également été utilisé pour les embryons de l'écran de l'aneuploïdie chromosomique spontanée (aussi connu comme PGS ou PGD-AS), afin de tenter d'améliorer l'efficacité de la procréation assistée, mais la valeur prédictive de ce test en utilisant la diffusion et la technique de FISH décrite ici est susceptible d'être beaucoup trop faible dans les mains de la plupart des gens, et il n'est pas recommandé pour une utilisation clinique de routine. Nous décrivons le choix des sondes appropriées pour les mono-cellules de poisson, les techniques de propagation pour les noyaux des blastomères, et l'hybridation in situ et la notation du signal, appliqué aux DPI dans un cadre clinique.

Protocole

1. Lyse et la diffusion de noyau d'une blastomère biopsiés

  1. Tampon de lyse cellulaire des cellules propagation (0,2% de Tween 20 dans 0,01 M HCl, pH 2,0) doit être préparée 24 heures à l'avance et stocké à -20 ° C. Préparer 100 ml et 20 ml de filtre dans un conteneur de 30 ml stériles universelle en utilisant une seringue stérile de 20 ml et un filtre seringue. Distribuer des aliquotes de 1 mL dans 10 à 15 1,7 ml microtubes stériles, fermer et étiqueter les tubes avant de le congeler. Il est recommandé d'avoir deux lots différents est l'utilisation, le nouveau lot et le lot précédent, qui a été testé et peut être utilisé si le nouveau lot est insatisfaisante.
  2. Décongeler le tampon de lyse à température ambiante 30 minutes avant la biopsie. Pour des raisons pratiques, la température de travail se situe entre la température ambiante et la température de la main.
  3. Score d'un petit cercle (environ 5 mm de diamètre) sur la partie inférieure d'une lame d'amine-couché (par exemple Genetix) en utilisant un stylo de diamants et de pré-label de la diapositive avec le numéro de dossier, numéro de la diapositive unique, et la date de biopsie. Utilisez une lame séparée pour chaque blastomère dans l'ordre numérique, et l'étiquette avec le numéro de l'embryon. Les diapositives doivent être étiquetés avec un crayon dur comme 4H, et "effacé" avec un gant de latex pour enlever toute la poussière de graphite.
  4. Placez un petit volume de tampon de lyse dans le cercle.
  5. Transférer le blastomère biopsié dans le tampon de lyse. Si nécessaire, ajouter un tampon de lyse dans le cercle jusqu'à ce que la cellule commence à se lyser, la cellule doit lyser complètement et le cytoplasme se disperser avant le séchage de la mémoire tampon.
  6. Observez le noyau afin de s'assurer qu'il reste dans le cercle et ne sont pas perdues; si la cellule n'a pas de noyau ou a noyaux multiples, la biopsie d'une autre cellule.
  7. Laisser la lame sécher à l'air à température ambiante.

2. Hybridation in situ d'un seul noyau de blastomères

  1. Préparer une série d'éthanol (70, 90 et 100%), composé dans l'eau distillée stérile.
  2. Allumez-le et mettre le bloc chaud (par exemple Hybaid Omnislide ou Vysis Hybrite) à 75 ° C.
  3. Sondes de dégivrage, vortex et centrifuger. Les réactifs doivent être témoin et vérifiées pour être correcte avant de faire le mélange de la sonde. Volumes de pipette comme spécifié par le fabricant pour rattraper le mélange de sonde dans un tube à 0,65 ml microtubes stériles et le vortex et centrifuger avant l'utilisation. Le volume total du mélange de la sonde devrait être suffisante pour permettre à 2 l par le noyau pour être testé et arrondi au plus proche des 10 uL pour permettre une marge de sécurité.
  4. Pré-laver les lames dans des bocaux Coplin en utilisant un tampon phosphate salin (PBS) (pH 7,0: 0,14 M de NaCl, 3 mM de KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) pendant 5 min à température ambiante.
  5. Rincer les lames à deux reprises dans de l'eau distillée stérile.
  6. Déshydrater les lames avec la série d'éthanol (70, 90 et 100%) pendant 2 min chacun à la température ambiante et l'air sec. Assurez diapositives sont entièrement immergés et si toute la poussière de graphite flotte à la surface, éponger avec un tissu propre.
  7. Enregistrer la position du noyau dans le cercle en visualisant avec un microscope à contraste de phase.
  8. Déshydrater à l'éthanol à 100% pendant 2 min à température ambiante et l'air sec.
  9. Appliquer 2 pl de mélange de sonde, et couvrir avec une lamelle de 9 x 9 mm (un quart de 18 x 18 mm lamelle n ° 1).
  10. Scellez les bords de la lamelle de caoutchouc ciment (gomme de vache par exemple; Proofing vache).
  11. Codenature les diapositives sur un bloc chaude à 75 ° C pendant 5 min, puis l'hybridation des diapositives nuit (16-20 h) dans une chambre humidifiée à 37 ° C. Mêle sonde constitués entièrement de sondes centromère (ie pour liée au sexe des cas) donnera un résultat satisfaisant après 60 min d'hybridation.
  12. Préparez un bain d'eau avec des jarres Coplin suffisant et la chaleur à 71 ° C.
  13. Préparer un 0.4x citrate saline standard (SSC) de solution de lavage sévères (pH 7,0 à 71 ° C, 0,06 M de NaCl, 6 mM C 6 H 5 Na 3 O 7 .2 H 2 O) et de chaleur dans l'eau du bain.
  14. Déposer 50 ml de lavage rigoureuses par Coplin jar nécessaires et vérifier que la température est de 71 ° C immédiatement avant l'utilisation à l'aide d'un thermomètre propre.
  15. Retirer délicatement le ciment de caoutchouc de chaque diapositive et rincer la lamelle à l'aide 4x SSC/0.05% de Tween 20 (pH 7,0) à température ambiante.
  16. Laver les lames dans le lavage SSC 0.4x strictes à 71 ° C pendant 5 min. Lavez pas plus de 6 diapositives par jarre de Coplin.
  17. Laver les lames dans Tween 20% SSC/0.05 4x à température ambiante pendant 2 min.
  18. Si le mélange sonde contient la sonde indirectement marqué (s), égoutter les diapositives de l'excès de liquide et d'appliquer 20 uL d'anticorps par fluorescence conjugué dans un carré de 20 x 20 mm de Parafilm.
  19. Incuber dans une chambre humidifiée à 37 ° C pendant 15 min.
  20. Retirez le Parafilm et laver une fois dans Tween 20% SSC/0.05 4x à température ambiante pendant 2 min.
  21. Laver deux fois pendant 2 min dans du PBS unela température ambiante t et égoutter les lames.
  22. Appliquer 6 uL d'DAPI / Vectashield (160 ng de 4 ',6-diamidino-2-phénylindole dihydrochlorure dans 1 ml de milieu de montage Vectashield, Vector Laboratories) à un 22 x 22 mm non. 0 lamelle et inverser la glisser sur la lamelle.
  23. Blot et sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles transparent.

3. Analyse au microscope à fluorescence convenablement équipé avec des filtres appropriés pour les sondes utilisées.

  1. Score signaux par visualisation directe en utilisant un microscope à fluorescence et unique filtres passe-bande pour chaque fluorochrome dans le dosage. Chaque noyau devrait être marqué par deux analystes. Une ligne directrice générale devrait conduire à marquer d'un signal unique lorsque deux signaux sont espacées de moins d'un domaine (le signal de largeur) à part, cependant, le jugement fondé sur l'expérience doit être exercé à interpréter les signaux de taille variable, l'intensité et de séparation.
  2. Utiliser un logiciel d'imagerie (par exemple Isis, métasystèmes, Altlussheim, Allemagne; CytoVision, Genetix) pour capturer une image du noyau pour la confirmation du diagnostic visuel, et pour l'archivage des images dans le cadre d'un plan d'assurance qualité du laboratoire.

4. Les résultats représentatifs:

Métaphase et noyaux interphasiques de cultures de lymphocytes du sang périphérique devraient être examinés pour confirmer que les sondes sélectionnées sont spécifiques pour les chromosomes de translocation, instructive pour les points d'arrêt (les sondes subtelomere devrait s'hybrider seulement pour les segments translocation et la sonde centromère (s) à l'centric segment (s)) et les signaux dans les noyaux interphasiques doit être brillante et discrète. Notation du nombre de signaux pour chaque sonde dans 100 noyaux interphasiques de chaque partenaire est recommandé d'évaluer l'efficacité de l'essai. Dans ce cas, deux signaux ont été marqués en 95% -99% de noyaux pour chaque sonde. La figure 1 montre une métaphase et noyau interphasique d'une préparation à une translocation réciproque entre les bras courts des chromosomes 5 et 9.

Signaux dans les noyaux interphasiques à partir de blastomères d'embryons doit être brillant et discret et marqué à l'aide séparées filtres passe-bande pour les couleurs utilisées. La figure 2 montre un noyau de blastomères avec un motif de signal normal (2 copies pour tous les loci testés) compatible avec un complément chromosomique normal ou équilibré pour le chromosome 5 et 9, et un noyau avec un modèle de signal anormal compatible avec un produit de la translocation déséquilibrée qui a monosomie (une copie) pour le segment transloqué du chromosome 5 et trisomie (3 copies) pour le segment transloqué du chromosome 9.

Figure 1
Figure 1 Un écart métaphase et un noyau interphasique préparés à partir de cultures de lymphocytes du sang périphérique à partir d'un porteur d'une translocation réciproque entre les bras courts des chromosomes 5 et 9 avec points d'arrêt à 5p14.3 et 9p24.1:. 46, XY, t (5 ; 9) (p14.3;. p24.1) ish t (5; 9) (5ptel48-, 9ptel30 +; 9ptel30-, 5ptel48 +, 9cen +). Sondes FISH ont été sélectionnés pour les deux segments translocation (5p14.3 → 5pter, rouge Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed; 9p24.1 → 9pter, vert Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC) et centrée sur le segment du chromosome 9 (9p24.1 → 9qter, bleu Abbott CEP 9 alpha-satellites SpectrumAqua).

Figure 2
Signaux Figure 2. Blastomère en interphase noyaux de jours-3 embryons capturées à l'aide d'un filtre différent pour chaque fluorochrome et ont fusionné pour former une image composite. (A) Deux signaux pour chaque sonde indiquant deux copies de chaque locus, ce qui est cohérent avec un complément normal ou équilibré pour les chromosomes de translocation. (B) Un signal rouge, vert et trois signaux de deux signaux bleu indiquant une copie du segment transloqué du chromosome 5, trois copies du segment transloqué du chromosome 9 et deux copies du segment centrique du chromosome 9, ce qui est cohérent avec les voisins -1 ségrégation de la translocation résultant en un produit déséquilibrée avec monosomie pour 5p14.3 → 5pter et une trisomie pour 9p24.1 → 9pter.

Discussion

L'application de l'hybridation fluorescente in situ (FISH) à une cellule d'embryon unique (blastomère) présente des défis particuliers à la fois dans les pratiques et dans l'interprétation du modèle de signal. La cellule de biopsie doit être réparti dans une zone pré-définie sur la lame afin de faciliter ses poissons de localisation suivants; un soin extrême doit être pris en veillant à ce que la cellule est lysée, que le cytoplasme a été dispersée, et que le noyau est visible et intacte, et, comme le diagnostic repose sur les résultats de cette cellule unique, la notation et l'interprétation stricte des lignes directrices devraient être appliquées. Toutefois, dans des mains expérimentées, le poisson est une technique robuste pour diagnostic pré-implantatoire génétique (DPI) en pratique clinique. Le principe du DPI par FISH est que les sondes spécifiques de la cible d'ADN marqués avec des fluorochromes différents ou haptènes peuvent être utilisés pour détecter le nombre de copies de loci spécifiques, et ainsi de détecter les déséquilibres chromosomiques associées à de ségrégation méiotique des réarrangements chromosomiques (1), y compris Robertsonienne translocations, translocations réciproques, inversions, et des réarrangements complexes (2). Le poisson peut aussi être utilisé pour sélectionner des embryons féminins dans les familles avec X-linked maladie, pour laquelle il n'existe pas de test de mutation spécifique (3, 4). De façon plus controversée, le poisson a également été utilisé pour dépister l'aneuploïdie chromosomique sporadiques afin d'essayer d'améliorer l'efficacité de la reproduction assistée (5, 6); toutefois, la valeur prédictive de ce test à l'aide FSIH est susceptible d'être trop bas dans la plupart des gens les mains et il n'est pas recommandé pour une utilisation clinique de routine (7). Cet article se concentre sur les aspects techniques et les limites de la FISH appliquée aux cliniques unicellulaires diagnostic.

Les méthodes de propagation et la fixation des blastomères simples comprennent méthanol / acide acétique (5, 8), Tween / HCl (9), et une combinaison de Tween / HCl et méthanol / acide acétique (10). Les variations incluent le traitement hypotonique des cellules avant l'épandage et / ou la pepsine et le traitement paraformaldéhyde après fixation. La méthode doit être correctement validé pour le laboratoire (14). La méthode Tween / HCl est décrite en détail dans cet article. La méthode Tween / HCl est techniquement simple et hautement reproductibles dans différents laboratoires. Cette méthode peut être utilisée pour préparer des noyaux simples pour le diagnostic FISH de la détermination du sexe et des réarrangements chromosomiques avec une précision acceptable de diagnostic (7).

Mêle sonde peut combiner directement et indirectement étiqueté sondes marquées, et des sondes de différents fabricants. Sondes pour connaître les régions du chromosome polymorphe (11, 12), ou ceux qui sont connus de contre-s'hybrider de façon significative avec d'autres chromosomes (13) doit être évitée, mais peut être utilisé s'il est démontré d'être précis et adapté à un DPI par des essais préalables sur les deux partenaires de reproduction . Fluorochromes disponibles / haptènes et des stratégies pour les sondes discriminante sont les suivantes: le rouge Texas (TR), l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, sondes biotinylées détectés avec TR-avidine, FITC-avidine, ou Cy-5 streptavidine (visualisés à l'aide d'un filtre Farred), un mélange de sondes rouges et vertes pour produire un signal jaune, un second tour de l'hybridation et une troisième couleur créé par la capture séquentielle des SpectrumOrange utilisant un TexasRed et un filtre SpectrumGold).

Un ensemble de sondes contenant trois sondes, spécifiques pour les régions de l'centromère des chromosomes X et Y et un autosome, est recommandé pour la détermination du sexe (14); la sonde autosomique est utilisé pour établir la ploïdie et ainsi faire la différence entre X trisomie (2n, 47 , XXX) et triploïdie (3n, 69, XXX), et entre tétrasomie X (48, XXXX) et tétraploïdie (4n, 92, XXXX). Une sonde typique située à appliquer dans ce contexte est le mélange AneuVysion Abbott contenant l'alpha-satellites X, Y, et 18; cet ensemble de sonde a été démontré que le polymorphisme ont un taux très faible, et donc de pré-traitement du travail de reproduction des partenaires Il n'est pas nécessaire (14).

Le mélange de sonde pour tout réarrangement spécifique doit: Idéalement contiennent des sondes au moins suffisant pour détecter tous les produits attendus de la transposition à un déséquilibre chromosomique. Si cela n'est pas possible, la sonde se mélange où les produits détectés déséquilibrés ont été évalués comme non viables dans une grossesse reconnaissables et sont susceptibles d'avoir une très faible prévalence peut être acceptable (14). Être testés sur des cultures de lymphocytes métaphases des deux partenaires de la reproduction. Au moins dix propage métaphase devraient être examinés pour la spécificité de la sonde, polymorphismes et hybridation croisée, et, pour le transporteur réarrangement chromosomique, afin de s'assurer que les sondes hybrident comme prévu aux différents segments du réarrangement. En outre, au moins 100 noyaux interphasiques de ces préparations doit être marqué d'évaluer la spécificité du signal, la luminosité et discret (14).

Commercial ensembles PGS sonde sont disponibles (par exemple, Abbott MultiVysion PB ou TCP), en ciblant les chromosomes les plus fréquemment trouvés à aneuploïdes dans les produits de la conception, et comprenant une seule sonde par chromosome ciblé. Typiquement le noyau peut avoir un seconde hybridation avec des sondes pour les chromosomes supplémentaires fournissant un test pour les chromosomes 13, 15, 16, 18, 21, 22, et XY (14). La valeur prédictive de ce test en utilisant la diffusion et la technique de FISH décrite ici est susceptible d'être beaucoup trop faible dans les mains de la plupart des gens et il n'est pas recommandé pour une utilisation clinique de routine (7, 15).

Des techniques telles que l'hybridation génomique comparative (CGH) appliquée à des cellules individuelles sont en mesure de tester pour le nombre de copies de chaque chromosome (Wilton et al. 2001), et l'utilisation de polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) des tableaux et l'analyse quantitative (Wells et al . 2008) ou "karyomapping« génotypage (Handyside et al. 2009) sont prometteurs techniques alternatives pour détecter l'aneuploïdie chromosomique. Toutefois, la limite de résolution et de précision pour le déséquilibre du segment restent incertaines et il est probable que les poissons continuent d'être la technique de choix pour les réarrangements chromosomiques impliquant de petits segments.

Déclarations de divulgation

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acide chlorhydrique, 2,5 LVWR international101254H
Chlorure de sodium, 5 kgVWR international443827W
Chlorure de potassium, 250 gVWR international26764.232
di-hydrogénophosphate de sodium anhydre, 500 gVWR international102494C
Phosphate monopotassique, 500 gVWR international10203 4B
Pastilles d'hydroxyde de sodium, 500 gVWR international28245.265
Tween20, 500 mLVWR international663684B
Éthanol, 2,5 LVWR international8.18760.2500Droits acquittés
Citrate de sodium tribasique, 5 kgVWR international27833.363
Colle pour vache, 250 mLCow Proofings Ltd.Indisponible désormaisDe vieux stocks peuvent encore être trouvés dans les magasins d'art
DAPI/Antifade ES, 0,125μg/mL, 500 µlCytocell Ltd.DES500L150μl vial rec’d avec chaque sonde Cytocell TEL
Vernis à ongles, 12 mLBottes10088316001
Lames revêtues d'aminos, 25GenetixK2615
DAPI, 0,1 mLSigma-AldrichD-9542
Vectashield, 10 mLVector LaboratoriesH1000
Texas-Red-avidine, 0,001 mLVector LaboratoriesA-2016
FITC-avidine, 0,001 mLVector LaboratoriesA-2011
Streptavidine Cy-5, 0,001 mLGE HealthcarePA45001
Tubes de microcentrifugeuse, 1,75 mL, boîte de 500Thistle ScientificAX-MCT-175-C
Tubes de microcentrifugeuse, 0,6 mL, boîte de 1000Thistle ScientificAX-MCT-060-C-CS
Récipients universels de 30 ml, boîte de 400Sterilin128BDisponible auprès de NHS Supply Chain, n° de catalogue KCP053
Bloc chauffant
Brûleur à alcool Douille de brûleur à alcool Mèche de brûleur à alcoolVWR international451-0107 451-3112 451-3111
Pipettes en verre obturéesFisher ScientificPMK-300-052R
Microscope stéréoscopiqueWild Heerbrugg
Tissus, 100 boîtesCHAÎNE D'APPROVISIONNEMENT NHSMJT058
Plateaux de culture en métal
Plateaux en mélamine plastiqueVWR international682-009
Four
Embouchure de pipette buccaleScientific Laboratory Supplies LTDHAE3700
Tuyau
Filtre à seringue, 0,2 µmμtaille de pore de 0,45 µm, diamètre de 25 mmFisher ScientificFDM-340-010U
Stylo à pointe de diamantVWR international818-0021
Bloc chauffant pour lamesThermo Fisher Scientific, Inc.HBOSBB
Chambre d'hybridation
Rouleau de tissuCHAÎNE D'APPROVISIONNEMENT NHSMJT004
Schieferdecker JarVWR international631-9313
Bocal de CoplinVWR international631-9331
Pinces, finesVWR international232-2123
Pinces, effiléesVWR international232-2113
Bécher de 1000 mLVWR international213-1642
Microscope à contraste de phaseNikon InstrumentsE200
Cartes de transfert sans fibre, boîte de 100Fisher ScientificSDE1
Lames à microscopie bleues vernies, boîte de 100Scientific Laboratory Supplies LTDMIC3022
Coverslips, 18x18 mm, numéro 1, boîte de 200Scientific Laboratory Supplies LTDMIC3110
Coverslips, 22x22 mm, No. 0, boîte de 200Scientific Laboratory Supplies LTDMIC3104
Coverslips, 22x50 mm, No. 0, boîte de 100Scientific Laboratory Supplies LTDMIC3206
Seringue de 1 mL, boîte de 100NHS Supply ChainFWC045
Pointe de pipette de 1 mL, 10 boîtes de 1000Thistle ScientificAX-T-1000-C-L-R
IncubateurLEEC
Bain-marieÉquipement subventionnéW22
Thermomètre à alcoolDifférentes sources disponibles
pH-mètreJenway3305
Électrode de pHVWR international662-1759BNC mâle pour pH-mètre Jenway 3305
Agitateur chauffantBibbyHC502
Pipettes Pasteur de 1 mL, boîte de 500Scientific Laboratory Supplies LTDPIP4202
Parafilm, 50 mm x 75 mVWR international291-1214

Références

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Réimpressions et autorisations

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Hybridation in situ en fluorescencebiopsie embryonnaireremaniement chromosomiqueanalyse des chromosomes sexuelstalement nucl airehybridation de sondelavage stringentmicroscopie fluorescenceimagerie num rique
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