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Ligature de l'artère coronaire et injection intramyocardique dans un modèle murin d'infarctus

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DOI :

10.3791/2581

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7 juin 2011

 , 
1Department of Physiology, Brody School of Medicine, East Carolina University

Dans cet article

Résumé

De nombreuses manipulations génétiques et / ou injections intra-myocardique de gènes, de protéines, de cellules et / ou biomatériaux sont superposées la dimension du temps dans des études de l'ischémie aiguë / reperfusion et le remodelage chronique chez la souris. Cette vidéo illustre les procédures de microchirurgie de l'ischémie / reperfusion, la ligature des artères coronaires permanente, et les études d'injection intramyocardique.

Résumé

Les modèles murins constituent un outil précieux pour l'étude des lésions aiguës et du remodelage chronique du myocarde in vivo. Grâce à l'avènement de modifications génétiques appliquées à l'organisme entier ou au myocarde, ainsi qu'à une gamme de matériaux biologiques et/ou synthétiques, il existe un potentiel considérable à combiner ces approches afin d'atténuer l'ampleur des lésions ischémiques aiguës et de freiner l'apparition d'une insuffisance cardiaque consécutive au remodelage myocardique.

Nous présentons ici les méthodes et les matériaux utilisés pour réaliser de manière fiable cette microchirurgie, ainsi que les modifications nécessaires pour des études d'occlusion coronaire temporaire (avec reperfusion) ou permanente, ainsi que pour des injections intramyocardiques. Les effets sur le cœur observables pendant l'intervention et à la fin de l'expérience, en complément de l'évaluation histologique, permettront de confirmer l'efficacité.

En bref, la préparation chirurgicale consiste à anesthésier les souris, à raser le poil du thorax, puis à désinfecter la zone opératoire. L'intubation intratrachéale est réalisée par éclairage transœsophagien à l'aide d'une lumière à fibre optique. Le tube est ensuite relié à un ventilateur. Une incision effectuée sur le thorax expose les muscles pectoraux, qui sont sectionnés afin de visualiser les côtes. Pour les études d'ischémie/reperfusion, un morceau de tube en PE de 1 cm placé au-dessus du cœur permet d'attacher le ligature afin de personnaliser l'occlusion et la reperfusion. Pour les injections intramyocardiques, une seringue Hamilton équipée d'une aiguille stérile biseautée de 30 g est utilisée. Une fois les manipulations myocardiques terminées, la cage thoracique, les muscles pectoraux et la peau sont fermés séquentiellement. L'analgésie par blocage linéaire est réalisée à l'aide de marcaine à 0,25 % dans une solution saline stérile, appliquée sur la couche musculaire avant la fermeture de la peau. Les souris reçoivent une injection sous-cutanée de solution saline et sont placées dans une chambre de réchauffage jusqu'à ce qu'elles se redressent sur le sternum. Elles sont ensuite ramenées au vivarium et maintenues dans des conditions standard jusqu'au prélèvement tissulaire. Au moment de l'euthanasie, les souris sont anesthésiées, le cœur est arrêté en diastole par du KCl ou du BDM, rincé avec de la solution saline, puis immergé dans un fixateur. Par la suite, des procédures classiques de traitement, d'inclusion, de coupe et de coloration histologique sont réalisées.

L'intubation non chirurgicale d'une souris et les manipulations microchirurgicales décrites rendent ce modèle difficile à maîtriser et à reproduire de manière fiable. Ces procédures, combinées à la difficulté d'effectuer des manipulations reproductibles du ligature pour des occlusions temporisées et des reperfusions, ou encore des injections intramyocardiques, peuvent également affecter le taux de survie, rendant ainsi l'optimisation et la reproductibilité critiques.

Protocole

  1. Instruments chirurgicaux stériles (tableau 1) et 3 applicateurs de coton "à pointe sont placés sur une thibaude stérile. Le stérilisateur perles (Germinator 500) est activé.
  2. Souris (âge:> 6 semaines; poids:> 18g) sont anesthésiés par une injection ip de 20 pi / g pc de tribromoéthanol (250mg/kg; durée - environ 40 minutes).
  3. Lorsque les souris sont insensibles à l'orteil-pincement, un lubrifiant stérile (Larmes renouvelé) est appliqué sur les yeux pour les protéger contre le dessèchement et le côté gauche de la poitrine est recouverte d'épilation (par exemple Nair) pour enlever la fourrure de la peau.
  4. L'épilation est lavé avec de l'eau courante chaude et bétadine / alcool écouvillonnage est utilisé pour désinfecter la zone chirurgicale.
  5. La souris est placée sur un coussin chaud isotherme DeltaPhase qui est fixé à une table en plexiglas. Chaque membre est immobilisé à l'aide de bandes et d'un fil épais est placé horizontalement sous les dents du haut pour tenir la mâchoire supérieure en place.
  6. La table est positionnée verticalement et une lumière brilla fibre optique est directement sur la région du cou pour l'éclairage transoesophagienne. Cela nécessite un positionnement précis tels que l'ouverture de la gorge est considéré comme un orifice bien éclairé, permettant ainsi la trachée pour être visualisé pour faciliter l'insertion du tube PE.
  7. Le tube est ensuite relié au ventilateur (connecté à un O à 95% 2 / 5% CO 2) pour administrer constante ventilation à pression positive (TOPO ventilateur; taux de 125 respirations / min; pression inspiratoire de pointe de 10 à 12 cmH 2 O, note * : paramètres varient avec la souche et le sexe 1-3). Une fois la ventilation est confirmée par les mouvements de la poitrine synchrone, la connexion est fixée à la garniture avec du ruban adhésif pour éviter l'extubation pendant la chirurgie.
  8. En utilisant des pinces à dents pour tirer la peau et loin de la poitrine, une lame de scalpel stérile n ° 10 attaché à un manche de scalpel n ° 3 est utilisé pour faire une incision de 1,5 cm dans la peau parallèlement au sternum.
  9. Courbé microciseaux Vanna sont utilisés pour couper les muscles pectoraux et de faire un petit trou dans le muscle intercostal.
  10. Droite, microciseaux émoussées sont utilisés pour couper à travers trois côtes.
  11. Un spéculum ophtalmiques 9mm pédiatrique est utilisée pour retirer de la cage thoracique.
  12. Utilisation de la pince courbe, tirez le péricarde du coeur et de l'utilisation de la pince à griffes en douceur la déchirure de l'ouvrir.
  13. Utilisation du porte-aiguille Castroviejo, un point de 6mm fils d'aiguille conique 3 / 8 de la suture 8-0 polyéthylène sous l'antérieur gauche artère coronaire descendante (le long du grand axe du cœur) qui lui est perpendiculaire.
    1. Pour une ligature temporaire qui peut être retiré pour une reperfusion chronométré, un stérile de 0,5-1cm morceau de PE90 est placé sur le cœur en parallèle à l'artère coronaire. La suture, qui a d'abord été bouclé dans l'artère coronaire, est alors attaché à la tuyauterie. Au moment où il doit être libéré, la ligature est desserré. Ceci peut être répété à volonté et le temps d'occlusion / réocclusion peut être modifié 4. Selon la longueur du protocole et du type d'anesthésie utilisée, la supplémentation peut être nécessaire.
    2. Pour une occlusion permanente, la ligature lacée sous l'artère coronaire est simplement lié. Blanchiment et dyskinésie sont apparentes et la partie longue de la suture est coupé 5-10.
    3. Pour l'injection intramyocardique (s), une seringue stérile à Hamilton avec une aiguille de calibre 30 biseauté stérile est introduit dans la base du cœur au-dessus de la zone de blessure sur le côté droit de la ligature. L'aiguille est ensuite avancée dans le domaine de la blessure et retirer légèrement de sorte que le biseau peut être vu à peu près à la zone frontalière. Certains de la solution dans la seringue (2-3μl) est injecté dans le cœur et l'aiguille est maintenu en place. La seringue est retirée une autre 1-3mm et le reste de la solution est injectée. La seringue est maintenu en place jusqu'à ce que la bulle qui se forme par la solution se dissipe. L'aiguille est ensuite retirée. S'il ya un saignement, un applicateur coton-tige est doucement pressé sur le site insertion de l'aiguille jusqu'à ce que le saignement s'arrête 5-7.
  14. Une fois les manipulations du myocarde sont complets, des rétracteurs des côtes sont enlevées et la cavité thoracique est fermée avec 2-3 sutures utilisant 6-0 suture surgipro.
  15. Deux-trois sutures sont ensuite mis à fermer les muscles pectoraux, 1-3 gouttes de 1:10 marcaïne 0,25% dans une solution saline stérile (la souris 0.1ml/25g) est appliquée au muscle et ensuite 2-3 sutures sont faites pour fermer la peau.
  16. La souris est enlevé du ventilateur. Une fois que la respiration rythmique, rapide, superficielle est vérifiée, la souris peut être extubé.
  17. 0.5ml eau chaude salée stérile est injecté dans l'espace sous-cutanée dorsale et de la souris est placée sur un coussin réchauffement dans une cage jusqu'à ce qu'il retrouve la mobilité (1 heure minimum).
  18. Pour les expériences de survie, les souris sont replacés dans leurs cages et est retourné au vivarium jusqu'au moment du sacrifice. Pendant les 2 premiers jours, la nourriture est humidifiéplacé sur le plancher de la cage afin de faciliter l'alimentation (donc ils n'ont pas à atteindre ce qui peut causer de la douleur) et la buprénorphine devrait être administrée toutes les 6-12h. Soins post-opératoires comprend également un suivi quotidien de la première semaine afin de vérifier la mobilité suffisante, le toilettage, et les habitudes alimentaires.
  19. Les instruments chirurgicaux sont nettoyés avec de l'éthanol et inséré dans le stérilisateur cordon avant l'opération suivante.
  20. Au moment du sacrifice, les souris sont anesthésiées avec du pentobarbital de sodium (65mg/ml; 55-65 mg / kg). Quand un avion adéquat d'anesthésie est réalisée, la cavité thoracique est ouverte.
  21. Alors que le cœur bat encore, une seringue avec une aiguille de calibre 23 contenant du chlorure de potassium à froid (KCl, 30 mM) ou 2,3-butanedione monoxime (BDM; 10mM) est utilisé pour perforer la région postérieure basale du ventricule et la solution est injecté lentement dans la chambre jusqu'à ce que le cœur est arrêté en diastole.
  22. Une fois que le cœur est enlevé, une seringue contenant du PBS est utilisé pour perfuser rétrograde rincez le coeur d'enlever toute trace de sang qui reste. Pour études de toxicité aiguë, à la fin de la période de reperfusion, le DAL est re-ligaturé au point d'origine de l'occlusion. Une solution contenant 1% de bleu Evans est injectée dans l'aorte. Une fois que le coeur est extrait, il est coupé transversalement en 3 sections d'égale épaisseur, incubés dans 1% de chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium et imagé pour les analyses morphométriques 11. Pour les études chroniques, le cœur est ensuite immergé dans un fixateur, puis traitées et intégrées conformément aux procédures de routine. Les diapositives peuvent ensuite être teinté histologiquement et imagé pour les analyses morphométriques (à l'aide de Scion, NIH Image J, ou Image Pro Plus) 9,10,12.

Les résultats représentatifs:

Quand c'est fait correctement, le taux de survie chez les souris (mâles: l'âge de 8-10 semaines, 22-28g; femmes: âge 10-12 semaines, 20-26g) sont les suivants: plus de 90% à la phase aiguë d'ischémie / reperfusion et l'ischémie expériences préconditionnement, plus 85% dans les études permanentes ligature de l'artère, et environ 80% pour les injections intra-myocardique. Depuis blessures précoce est plus facilement visible par les changements métaboliques plutôt que structurel, détermination de la taille de l'infarctus chez une ischémie / reperfusion et ischémiques expériences préconditionnement est réalisé en injectant 1% de colorant bleu Evans dans l'aorte qui se perfuser le cœur qui n'est pas fourni par le DAL ( La figure 1A). Une fois que le cœur est enlevé et coupées transversalement en deux, le tissu est incubé dans une solution de 1% de chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium pour mesurer la taille d'infarctus (figure 1B). Les superficies sont mesurées à l'aide de Scion ou NIH logiciel d'imagerie qui peut être calibré à l'aide d'un micromètre imagé au même grossissement. Ces numéros sont utilisés pour calculer la superficie à risque / infarctus du ventricule gauche et la taille / zone à risque 11. Différences entre les souches peuvent entraîner des variations de poids corporel et la taille du cœur et si les soins doivent être prises pour normaliser ces mesures de poids du cœur, du poids corporel, ou la longueur du tibia à des fins comparatives.

Permanent des résultats ligature de l'artère en gros changements structurels tels que la nécrose, amincissement des parois, et la dilatation de chambre. Comparaison des effets du traitement et / ou de temps sur la taille de l'infarctus et la nécrose par rapport à la ventricule gauche, zone de la chambre, paroi septale et gauche épaisseur de la paroi libre du ventricule dans le modèle d'occlusion permanente (figure 2A) peut également être mesurée en utilisant l'imagerie Scion ou NIH logiciel. Coloration du collagène avec picrosirius rouge / vert rapide (figure 2B) peut être utilisé pour mesurer la fibrose insterstitial ce qui correspond à des indices fonctionnels de 8-10 raidissement mur. L'image de la figure 3 représente la distribution de la solution 6UL (bleu Evans) injecté dans la zone frontière de la ligature de l'artère cardiaque après permanente. Notez que c'est un produit dans le sens de la blessure ainsi que vers la base et également transmurale.

Figure 1
Figure 1. A. Evan l 'Bleu injecté dans l'aorte avant l'excision. Cette image montre les régions perfusées du cœur (teint) et la zone occluse (non coloré). Evan B. l' Bleu et coloration TTC suivant l'ischémie aiguë / reperfusion. Ceci est une image représentative (20x) montrant la distribution du colorant bleu teinté où les régions sans occlusion ainsi que coloration des tissus viables TTC métaboliquement (rouge). Zones nécrosées ne tache pas et si elles restent pâles (décrites).

Figure 2
Figure 2. A. hématoxyline et éosine. Ceci est une image représentative (20x) de la coloration H & E d'un cœur de souris coupé transversalement dans la région d'infarctus à 4 jours post-IM (20x). Le * indique une nécrose des tissus, les flèches pointent dans les tissus de granulation, VD = ventricule droit et ventricule gauche = LV. B. Picrosirius rouge et vert rapide tache. C'est uneimage représentative (20x) de picrosirius rouge / fast coloration verte d'une coupe transversale de cœur de souris à 4 semaines post-IM. Le vert cytoplasme des taches et des fibres de collagène sont rouges.

Figure 3
Figure 3. Bleu d'Evans de distribution de teinture tache après l'injection intramyocardique 6UL. Ceci est une image représentative montrant la répartition mondiale et transmurale du colorant bleu Evan tout au long du coeur suite à l'injection intramyocardique 6UL à la zone frontalière, immédiatement après la ligature des artères coronaires (12x).

Discussion

Les maladies coronariennes continue d'être un point de vue épidémiologique et fiscalement problème important de santé publique. Considérables de la recherche fondamentale sont encore nécessaires pour comprendre les mécanismes par lesquels les blessures et le remodelage et comment procéder thérapeutiques potentiels susceptibles de moduler ces processus, si elles doivent être développés pour une utilisation clinique. Les rongeurs sont les plus couramment utilisées et la vaste gamme de souris génétiquement modifiées disponibles rend cette espèce un modèle plus attrayant.

Bien qu'il existe des différences entre les souris et les autres espèces, il ya beaucoup d'avantages à un modèle murin. L'utilisation d'un champ simple, dissection ou une loupe et des conditions bien éclairés permettent la vascularisation d'être facilement vu (pour anatomie détaillée de la vascularisation, voir Salto-Tellez et al., 2004 13). Pour réduire le risque de mortalité postopératoire, il est très important d'éviter de rompre les grands navires, puisque le volume total de sang de souris 25g est inférieure à 2 ml 14. Dans le cas où survient un saignement excessif, l'application d'une pression douce ou la cautérisation identifier peut être utilisé pour arrêter le saignement.

Cette procédure peut également être modifié dans une variété de façons. Par exemple, les souris peuvent être anesthésiés en utilisant l'isoflurane, la kétamine / xylazine, ou du pentobarbital de sodium et de la sélection approprié est déterminé par la durée du protocole de 15-18. Le réflexe des orteils pincement est l'indice le plus couramment utilisé de la profondeur de l'anesthésie. En outre, pour améliorer la probabilité de survie à long terme, certains chercheurs utilisent les médicaments anti-arythmiques tels que la lidocaïne pour réduire l'incidence des arythmies mortelles 19,20 cependant, il doit être pris en compte que cela a été récemment démontré avoir des propriétés anti-apoptotiques dans un aiguës modèle 21. Aussi, pour réduire les douleurs post-opératoires, les analgésiques tels que la buprénorphine peut être administré pendant les 48 premières heures après la chirurgie 3,16,17,22,23. Pour maintenir la température du corps pendant la chirurgie (surtout pour les plus de protocoles), une sonde rectale en série avec un coussin chauffant est souvent utilisé à la place du pad isotherme. Pour l'ischémie / reperfusion et / ou ischémiques pré-ou postconditionnement: la durée de l'occlusion (s) et de la reperfusion (s) peut être modifiée, car une occlusion permanente, la taille de l'infarctus peut être modifiée en ajustant la position de la ligature; et pour les injections intra-myocardique (par exemple les cellules, les protéines), il peut y avoir d'injection endroits 1-3 et le volume par injection peut être jusqu'à 15 24 pl. Si les cellules sont injectées, le calibre de l'aiguille utilisée (généralement 26-30) 5,25,26 doivent être choisis en fonction de la taille des cellules de sorte que le diamètre interne de l'aiguille est assez grand pour éviter la tonte. Pour éviter confond en raison de processus inflammatoire déclenchée par la chirurgie, certains chercheurs ont déclaré utiliser un piège qui est manipulé ex vivo à s'obstruer et reperfuser les cœurs dans une souris à thorax fermé à tout moment après la chirurgie 27-29. Plus récemment, Gao et al. 30 ont montré que l'occlusion temporaire et permanent peut être réalisé sans la nécessité d'une ventilation et un peu de laboratoires ont commencé à utiliser les ultrasons pour effectuer thorax fermé intramyocardique injections 25,31.

Depuis la première étude démontrant la faisabilité de la ligature des artères coronaires chez des souris a été publiée par Johns et Olson en 1954 32, de nombreux autres ont adopté ce modèle et l'a modifié pour étudier divers aspects de la lésion du myocarde et le remodelage 3,33-45. La nature de la souris en termes de taille, la capacité de reproduction, et les frais relativement moins à l'achat et l'entretien font de cette espèce un outil attrayant pour un large éventail d'études physiologiques et physiopathologiques. Comme la miniaturisation de la technologie pour l'imagerie in vivo en avances 46-49, ainsi que les moyens d'exécuter et d'analyser la génomique à grande échelle et de la protéomique, criblage de médicaments, l'efficacité des thérapies basées sur les cellules et / ou des protéines ainsi que des biomatériaux 50-64, combinée avec la gamme plus large de manipulations génétiques offertes par ubiquitaire ou spécifique de tissu des souris transgéniques ou mutantes / KO, le modèle murin d'infarctus du myocarde sans aucun doute continuer à être un outil précieux dans l'évaluation de lésion cardiaque aiguë et à long terme de remodelage. Par conséquent, il ya une valeur incontestable d'être en mesure d'effectuer ces expériences de manière fiable et reproductible.

Déclarations de divulgation

Ce protocole a été approuvé par les animaux et est en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation à l'East Carolina University.

Remerciements

Je tiens à remercier le ministère de la Recherche et études supérieures pour fournir des fonds pour soutenir mes recherches et le département de médecine comparée pour leur vigilance et leur aide. Je tiens également à reconnaître le Département de physiologie pour leurs soutien et des conseils ainsi que les étudiants et techniciens dans mon laboratoire pour leur aide. Enfin, je tiens à remercier mon post-doctorat mentor, le Dr Charles E. Murry, pour l'occasion une formation au cours de laquelle j'ai appris la microchirurgie de la souris.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Ciseaux longs de VannaGeorge Tiemann & Co.160-159
Ciseaux de dissection microchirurgicauxGeorge Tiemann & Co.160-161
Pinces – droites, 1x2 dentsGeorge Tiemann & Co.105-205
Manche de bistouri n°3George Tiemann & Co.105-64lame stérile n°10
Pinces – courbées à moitié, canneléesGeorge Tiemann & Co.160-19
Ciseaux pour tissusGeorge Tiemann & Co.105-410
Porte-aiguille CastroviejoMiltex Inc.18-1828
Spéculum oculaire CookMiltex Inc.18-63
Surgipro II 8-0Suture ExpressVP-900-X
Prolene 6-0Suture Express8776
Stérilisateur à billes Germinator 500Cellpoint Scientific65369-1
Alèse isotherme DeltaphaseBraintree Scientific, Inc.39DP
Seringue Hamilton - 25μlHamilton Co80430
Aiguille biseautée 30 gaugeHamilton Co7803-07
VentilateurKent ScientificTOPO

Références

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