Mesure de la coordination motrice chez la souris

Résumé

Les protocoles sont présentés pour deux tâches établies à moteur de coordination, le bar rotarod et horizontale accélération, également deux tests développés à Oxford récemment, les tiges statiques et aux barres parallèles. Ces tests peuvent détecter une déficience motrice potentiellement d'intérêt de leur propre chef, tout en étant variables possibles dans les tests d'autres domaines du comportement.

Résumé

Les souris sont de plus en plus utilisés dans les neurosciences comportementales, remplaçant en grande partie rats comme animaux de la comportementaliste de choix. Avant aspects du comportement tels que l'émotivité ou de la cognition peuvent être évaluées, cependant, il est essentiel de déterminer si les capacités motrices de par exemple une souris mutante ou lésé permettent une telle évaluation. Performance sur une tâche labyrinthe nécessitant force et de coordination, comme le labyrinthe d'eau de Morris, pourrait bien être altérée chez la souris par le moteur, plutôt que cognitif, troubles, il est donc essentiel de disséquer de façon sélective le dernier de l'ancien. Par exemple, des déficiences sensori causé par les antagonistes NMDA ont été montrés à porter atteinte à l'eau performance dans le labyrinthe ^2.

La coordination motrice a traditionnellement été évaluée chez la souris et le rat par le test de la tige tournante, dans lequel l'animal est placé sur une tige horizontale qui tourne autour de son axe longitudinal; l'animal doit marcher vers l'avant pour rester debout et ne pas tomber.La vitesse de consigne et versions accélération de la rotarod sont disponibles.

Les trois autres tests décrits dans cet article (barre horizontale, barres fixes et barres parallèles) tous coordination de mesure sur un appareil statique. La barre horizontale nécessite également la force pour une performance adéquate, en particulier des membres antérieurs comme la souris initialement saisit le bar juste avec les pattes avant.

Des rats adultes ne fonctionnent pas bien sur des tests tels que les barres fixes et barres parallèles (observations personnelles); ils semblent moins bien coordonnées de la souris. Je n'ai testé que chez les rats mâles, cependant, et les souris mâles semblent généralement moins bien coordonné que les femelles. Les souris semblent avoir une plus grande résistance: ratio de poids que les rats, le nom latin, Mus musculus, semble tout à fait approprié. Le rotarod, les variations de l'essai de faute de pied ¹² ou ¹⁵ appareils Catwalk (Noldus) sont généralement utilisés pour évaluer la coordination motrice chez le rat.

Introduction

Comportement se manifeste par l'action, et l'action nécessite la motricité, y compris la coordination de l'organisme. Une des premières expériences de l'histoire du comportement animal a été réalisé par Colin Stewart, un étudiant au doctorat à l'Université Clark aux États-Unis ^11. Il a mesuré l'activité de rats en les mettant dans un tambour et compté le nombre de fois où il se retourna. Cet appareil précoce est probablement l'ancêtre de galets de roulement et le test de la tige tournante actuellement utilisé, mais dans l'appareil Stewart le rat était à l'intérieur du tambour, dont le mouvement a été entraîné par le rat, tandis que dans le rotarod l'animal se promène à l'extérieur un tambour ou d'une tige rotative qui est entraînée par un moteur.

La tige d'origine utilisé par Dunham et Miya (1957) ⁷ avait une vitesse de consigne, mais les versions accélération de nos jours (Jones et Roberts 1968), ⁹ sont disponibles. L'inconvénient d'une tige tournante de vitesse réglée est que certains animaux en mauvaise coordination vont tomber àle début, alors que pour ceux qui ne restent sur le test va bientôt commencer à mesurer l'endurance plutôt que de coordination en soi. La distribution bimodale de points de données qui en résulte peut être suffisamment anormal de manière à exclure l'analyse paramétrique. Quand un rotarod accélération est utilisé, en particulier si elle est accélérée que si un critère d'ensemble, comme de rester pendant 10 sec, est atteint, la distribution des données est plus susceptible d'être gaussienne. Le taux d'accélération peut être ajustée de sorte que la fatigue du moteur ne joue pas un rôle important dans la performance; une souris est peu susceptible d'être nettement fatigué après seulement 2-3 min temps de la tige tournante.

Le «test de chaîne" ^1, "test de cintre" ou barre horizontale mesure la force et la coordination des membres antérieurs. Les deux épithètes cités se rapportent à son développement; l'origine une chaîne a été utilisé, mais les auteurs ont noté que la performance dépend beaucoup de la façon tendue la chaîne était, par conséquent, les expérimentateurs futurs utilisé une barre de métal, souvent un cintre. Nous avons constaté que la capacité d'une souris pour saisir la barre est inversement proportionnelle à son diamètre, et nous avons utilisé un bar en standard de 2 mm. Dans le test de poids (voir le protocole JoVE «Mesurer la force de souris»), le fil très fin de la fourrure / échelle collecteur de chaudière permet aux animaux les plus forts pour sécuriser une bonne prise en main qu'ils peuvent soulever plus que leur propre poids corporel. Cependant, en utilisant des barres horizontales de grand diamètre peut être un avantage que la sensibilité du test s'améliore; avec seulement une barre de 2 mm souris C57BL / 6 plus normales atteignent des performances de plafond. C'est pourquoi nous avons récemment adopté un dispositif à trois barres, les barres peuvent être facilement interchangeables car ils s'inscrivent dans des encoches taillées dans les sommets des colonnes de soutien. Les barres sont maintenues sous tension (particulièrement important de faire la barre de 2 mm rigide) car ils ne s'intègrent les encoches lorsque les supports sont légèrement rapprochés (comme un arc et sa corde) (voir figure 3).

Tiges ou poutres statiques ont souvent été utiliséespour mesurer la coordination, mais la motivation supplémentaire a été toujours utilisé pour persuader les animaux de traverser la tige. Ils ont négocié une poutre horizontale pour atteindre un objectif souhaité, comme la cage d'accueil, refuge d'une lumière vive, ou de la nourriture (si elles ont été accomplis faim). Cependant, dans le cadre d'une enquête de ce type de test, j'ai découvert que les souris seraient spontanément tourner lorsqu'il est placé sur le côté «ouvert» d'une tige en porte à faux, et ensuite le parcourir jusqu'à ce qu'ils atteignent la fin soutenue. Cette technique élimine le besoin de formation (nécessaire dans les variantes de tests mentionnés précédemment) que la réaction innée d'une souris pour être placé près de l'extrémité d'une tige élevée est de tenter de parvenir à la fin soutenue. Cela ne signifie pas, bien sûr, d'éliminer le problème des changements de motivation peuvent affecter les performances, ce qui est toujours une possibilité avec ce type de procédure.

tunnels en carton sont actuellement très utilisées pour la maison cage enrichissement de l'environnement, mais leur défavue dans le contexte actuel est que les animaux vont inévitablement être pratiquées dans l'équilibrage des cylindres qui peuvent vacillent sur leur axe long, imitant les compétences nécessaires pour équilibrer le rotarod. Ainsi, l'enrichissement de la cage à la maison pourrait masquer un phénotype comportemental, un exemple est l'amélioration de la maladie le phénotype de Huntington par l'enrichissement ^14. Aussi les animaux se promènent souvent le long de l'axe long de ces tunnels, comme lors de la marche le long d'une poutre statique élevée. C'est pourquoi j'ai construit une paire de barres parallèles élevées, et placé les souris dans le milieu avec les pattes de devant sur une barre et les pattes arrières de l'autre, une situation qu'ils n'auraient jamais rencontrées auparavant. Souris devaient atteindre le soutient extrémité des barres parallèles, tout en restant debout pour passer le test. Un dispositif quelque peu similaire a été une série de barres parallèles placés dans une cage de la souris afin d'évaluer le développement de la dysfonction motrice ¹³ tremblante induite.

Nous avons testé plusieurs centainessouris pour le fonctionnement du moteur à Oxford. Ceux-ci avaient reçu plusieurs traitements, y compris des agents pharmacologiques ou transfert passif de tissu (plasma) chez l'homme, mais surtout des animaux génétiquement modifiés. Certains animaux sont plus dépréciés sur la force de tâches de coordination, d'autres vice-versa. Certaines souris sont plus dépréciées en rotarod que sur des supports statiques tels que les barres fixes et barres parallèles, les autres vice-versa. Ainsi, le présent article et le protocole JoVE accompagnement "Mesure de la force chez les souris") décrivent comment caractériser la manière dont les différents traitements et les mutations peuvent affecter différemment la fonction motrice chez la souris. En dehors de la rotarod l'appareil décrit ici est simple, pas cher et particulièrement adapté pour les laboratoires non spécialisés pour tester la motricité. Pour l'analyse de la marche à petite échelle, le système Catwalk est un système beaucoup plus sophistiqué que les anciennes méthodes telles que convaincre une souris de marcher à travers un bain d'encre et puis vers le bas un morceau de papier, mais c'est une expensive pièce de l'appareil.

Tous ces tests sont conçus pour mesurer la coordination plutôt que la force, même si évidemment un degré minimal du tonus musculaire est nécessaire simplement pour la souris à utiliser ses membres. Pour l'évaluation de la force, la procédure de l'écran inversé ¹⁰ est plus approprié, ou, si une mesure plus graduelle est requise, le test de poids ou de son automatisé bar-pull équivalent (décrit dans le protocole JoVE "force de mesure chez les souris»). L'exception est le test de la barre horizontale, ce qui nécessite à la fois la force et la coordination pour une performance réussie.

Protocole

1. Appareil

Pour tous les essais, d'une surface molle rembourrée est placé à la base de l'appareil pour amortir les souris qui tombent. NB Ce n'est pas représenté sur les figures, afin de ne pas occulter une partie de l'appareil. Lors de l'essai sur des centaines de souris, à la fois normal et mutant, nous n'avons jamais observé de tout dommage causé par la chute de cet appareil, qui est généralement de 30-50 cm de haut. Aussi, n'oubliez pas de nettoyer et de stériliser le matériel entre chaque souris testées.

1.1 Rotarod

Il existe plusieurs versions commerciales de cet appareil sur le marché, mais certains ont des inconvénients, comme le défaut d'accélérer à une vitesse suffisante pour détecter une incoordination motrice (plutôt que de l'endurance). Une autre erreur fréquente est que la tige n'est pas assez élevé au-dessus de la base, ce qui entraîne chez les souris ayant tendance à baisser ou sauter.

Le rotarod illustré à la figure 1 a été faite à la conceptionde l'auteur par les sections techniques du département de pharmacologie de l'Université d'Oxford. La tige est de 3 cm de diamètre, 30 cm de charge au-dessus du fond de l'appareil. La surface est moletée en une série de nervures parallèles le long de l'axe longitudinal, ce qui permet aux souris de la saisir de manière efficace (figure 2). NB La profondeur des stries est un détail essentiel: si la souris ne peut pas obtenir une bonne adhérence le test sera très difficile, d'autre part, si la poignée est trop bonne la souris "roue" autour de la tige en tenant passivement sur elle. Pour les "décideurs rotarod amateurs", il peut être utile de savoir que goujons en bois molette d'une taille appropriée pour les souris est disponible dans le commerce, il serait évidemment besoin d'être traités avec un bon vernis hydrofuge avant de l'utiliser. La vitesse de démarrage est ajusté à 4 tours par minute, le taux d'accélération de 20 tpm / min. La vitesse maximale est de 40 rpm.

Deux brides empêcher la souris de sortir la tige. Ils sont 30 cm de diamètre (cepourrait sans doute être ramenée à 20 cm). Leur séparation est fixé à 6 cm (maximum), mais il peut être nécessaire d'ajuster plus petit pour les souris sub-adultes s'ils ont tendance à tourner autour de la tige.

1.2 barres horizontales Triple (Figure 3)

Les barres sont faites de laiton, 38 cm de long, qui s'est tenue 49 cm au-dessus de la surface de banc par une colonne de support en bois à chaque extrémité. Les colonnes sont fixés sur un socle en bois lourd. Trois diamètres de barres sont disponibles: 2, 4 et 6 mm. La barre de 2 mm est le standard que nous utilisons, mais beaucoup de souris atteindre des scores maximum sur ce point. Par conséquent barres de grand diamètre ont été inclus dans une tentative pour affiner le test, les souris ne peuvent pas saisir ces si bien.

1.3 barres statiques

Cinq chevilles de bois ou de tiges d'épaisseur variable (35 (tige 1), 28, 22, 15 et 9 (tige 5) mm de diamètre) chacune 60 cm de long sont fixés par un serre-joint à une étagère de laboratoire tels que les tiges dépassent horizontalement dans l'espace (figure 4). La finde la tige près du banc a une marque à 10 cm de la fin pour désigner la ligne d'arrivée. La hauteur des tiges au-dessus du sol est de 60 cm.

Si un test plus courte et moins détaillée est nécessaire, utilisez uniquement les plus grands, les plus petits et les tiges milieu. Van Dellen et al. ¹⁴ utilisé une seule tige pour évaluer les progrès de la maladie de Huntington chez des souris.

1.4 Barres parallèles

Deux barres d'acier parallèles de 1 m de longueur et 4 mm de diamètre sont fixés 30 mm (sur leurs centres) d'intervalle par des colonnes de soutien en bois à leurs extrémités (figure 5). Les bars sont à 60 cm du sol.

2. Procédure

Pour tous les tests, apporter des souris à la salle expérimentale 5-20 min avant le test, pour s'assurer qu'ils sont pleinement éveillé. En règle générale, pour permettre la récupération de la force musculaire et un retour à des niveaux normaux d'éveil, reposer les souris par un retour à la cage à la maison après chaque essai moteur.

2.1 Rotarod

Régler la tige tournante avec une vitesse de départ de 4 tours par minute, le taux d'accélération de 20 tours / min. En tenant la souris par la queue, et le placer sur la tige rotative, opposée à la direction de rotation de sorte qu'il doit marcher en avant pour rester debout. C'est la plus facile à faire si la souris est mise en place en direction de la tige à un angle de 45 ° sous l'horizontale; tenter de diminuer la souris au-dessus entraînera elle étend ses pattes de derrière et de saisir les bords des brides. Brièvement sur la souris quand il est presque toucher la tige, juste en avant et au-dessus des tiges point mort haut, ce qui lui permet de saisir facilement la tige. Une technique (probablement plus facile et plus fiable) est d'utiliser un (10-15 mm) cheville mince. En tenant la souris dans une main, l'abaisser sur la cheville, parallèle à l'axe long. La cheville est inclinée avec la tête vers le bas de la souris environ 30 ° pour lui donner plus de temps pour saisir le rotarod fois qu'il est libéré. Abaissez la souris et le goujon entre èmee brides de la tige tournante, et une fois sur la tige tournante de la traction de la cheville vers le bas à partir de la souris, qui va saisir la tige et marcher vers l'avant.

A 10 secondes après plaçant la souris sur la barre, pour démarrer l'accélération (tant que la souris est tourné vers l'avant: sinon, attendre qu'il ne l'avant visage avant de commencer l'accélération), et notez la vitesse à laquelle la souris tombe. Si elle tombe avant 10 sec, noter le temps de chute et réessayez, jusqu'à trois fois au total, l'enregistrement de la vitesse à la première chute après le point 10 sec. Toutefois, les chutes avant 5 sec qui sont dus à une mauvaise mise par l'expérimentateur ne doit pas être enregistré. La vitesse moyenne à l'automne est la donnée, plutôt que d'utiliser la vitesse maximale, cette corrige pour la pratique supplémentaire de la souris reçoit pendant les courses échoué, ce qui est supposé aiderait performance. Ainsi, une souris qui tombe avant 10 sec reste une fois puis sur jusqu'à 12 rpm deuxième scores de temps (4 +12) / 2 = 8 min. Une souris de tomber deux fois puisrester pendant 10 tours scores (4 +4 +10) / 3 = 6 rpm. Si une souris échoue à saisir dans 10 sec trois fois lui attribuer un score de 4 tours.

Un des problèmes est que les souris s'arrêtent parfois marchant vers l'avant et la poignée de la tige fermement à la place, de sorte qu'ils passivement périlleux tour, mais la plupart finissent par tomber. Il pourrait donc être utile de noter également la vitesse lors de la première telle inversion se produit. Une solution possible serait d'utiliser une tige avec un diamètre supérieur ou crêtes moins prononcées.

2.2 Les barres horizontales

Comme les souris trouvent qu'il est plus facile de saisir la barre étroite de 2 mm, il est conseillé de les tester d'abord sur celui-ci. En tenant la souris par la queue, le placer sur le banc en face de l'appareil, faites-le glisser rapidement vers l'arrière d'environ 20 cm (ce qui aligne perpendiculaire à la barre), rapidement soulever et laisser saisir la barre horizontale au point central avec ses pattes de devant seulement, et de libérer la queue, en commençant simultanément le chronomètre. Ce cun être difficile à atteindre efficacement; certaines souris meilleure adhérence si la queue est relâchée soudainement, s'ils sentent qu'ils sont toujours pris en charge, ils peuvent échouer à saisir. Le point de critère est soit une chute de la barre avant que la souris atteint l'une des colonnes d'extrémité de la barre, ou le temps jusqu'à une patte touche une colonne. Temps d'essai maximale (cut-off time) est de 30 sec.

Si la souris ne parvient pas à saisir la barre correctement première fois et cela semble être attribuable à la technique de l'expérimentateur, plutôt que la souris, essayez à nouveau (après un bref repos pendant une ou deux souris sont testés) et ne pas enregistrer cet automne. Si la souris tombe avant 5 sec et ce n'est apparemment pas dû à une mauvaise mise par l'expérimentateur, répéter jusqu'à trois fois dans une tentative d'obtenir un> 5 Note sec. Si> 5 sec sur la deuxième tentative, ne pas faire un troisième procès. Prenez le meilleur score que la donnée. Une souris qui échoue à plusieurs reprises pour se soutenir pendant> 5 sec scores seulement 1.

Si la version triple-barre est utilisée, si le score de souris 5 de cette première barre de 2 mm, il peut ensuite être testé sur des barres plus épaisses, après une brève période de repos pendant une ou deux souris sont testés. Le système de notation pour les barres 4 et 6 mm est le même que pour la barre de 2 mm, et le score final est le total cumulé. Ainsi, une souris qui marque 5 de la barre de 2 mm mais tombe dans la barre de 4 mm au bout de 13 sec scores 5 +3 = 8.

2.2.1

Marquer les barres horizontales: les deux premiers intervalles sont moins les deux dernières fois que les souris ont d'abord maîtrisé la tâche qu'ils sont moins susceptibles de tomber:
Tomber entre 1-5 sec = 1
Se situant entre 6-10 sec = 2
Se situant entre 11-20 sec = 3
Se situant entre 21-30 sec = 4
Chute après 30 secondes = 5
Placer une patte sur un support de barre sans tomber = 5

NB que l'utilisation facultative de barres 4 et 6 mm est une nouvelle addition à notre protocole, nous n'avons pas encore vasteexpérience avec eux.

2.3 barres statiques

Placez la souris à l'extrémité de la tige la plus large (la longueur du nez pointe une tête de la fin est idéal). Prenez deux mesures: le temps d'orientation (temps nécessaire pour orienter à 180 ° de la position de départ vers l'étagère) et le temps de transit (le temps nécessaire pour se rendre à l'extrémité d'étagère (nez-delà de la cm marque de la fin de la durée de la tige 10).

L'orientation est dépendante de la souris rester en position verticale, si elle tourne à l'envers, et s'accroche au-dessous de la tige, d'attribuer arbitrairement (à des fins statistiques) la valeur maximale de l'orientation de 120 sec. Ne pas tester sur les petites tiges; aussi le temps de transit devient la valeur maximale comme une souris qui transite verticale est évidemment mieux coordonnée que celle qui transite alors accroché à l'envers.

Si, après l'orientation, la souris tombe ou qu'il atteigne le temps d'essai maximale (fixée arbitrairement à 120 sec) ne pas le tester sur sdes tiges de maller. À des fins statistiques, les souris attribuent la baisse sont affectés 120 pour que la tige particulier et pour les suivants, comme il est supposé qu'ils seraient de nouveau tomber d'une tige plus étroite. Si la souris tourne à l'envers, aussi souligner cet événement, pour le transit de succès ainsi que l'orientation qu'il doit rester debout sur la tige. Sinon attribuer la note maximale. Retirez la souris après avoir atteint l'extrémité de la tige ou de chutes.

Après avoir testé sur une tige de retourner la souris vers la cage à la maison pour se reposer pendant que vous testez une autre souris. Ensuite, placez-le sur la tige de la taille immédiatement inférieure et le tester dans la même façon. Arrêtez les tests si la souris tombe une tige après avoir été sur elle pour plus de 5 sec. Si elle est tombée en moins de 5 secondes le remplacer et permettre une nouvelle tentative (comme relevant de 5 sec pourrait être due à la mise défectueux par l'expérimentateur), pour un maximum de trois essais, et utiliser le meilleur résultat.

2.4 Barres parallèles

Placez la souris dans til centre des deux barres avec son axe longitudinal perpendiculaire à celui des barres, les deux pattes avant doivent être sur une barre, les deux pattes arrière de l'autre barre. La notation est similaire à celle des barres statiques. Prendre deux mesures: le temps nécessaire jusqu'à ce que la souris oriente 90 ° par rapport à la position de départ, et le temps jusqu'à ce qu'il atteigne la suite l'un des supports d'extrémité. Si la souris tourne à l'envers, aussi souligner cet événement. Quant aux tiges essai statique, l'orientation et de transit doivent être atteints sans elle tourner à l'envers, sinon la durée maximale est attribué. Il est rare que des souris raisonnablement sains de tomber en moins de 5 secondes, si cela se produit, il est probablement due à une mauvaise mise. C'est pourquoi jeter le résultat et retester la souris.

Résultats

Résultats attendus

Une tige statique a été initialement utilisé pour surveiller la progression de la maladie de Huntington chez des souris mutantes, avec ou sans enrichissement de l'environnement dans leurs cages à domicile ^14. Le programme d'enrichissement considérablement retardé l'apparition des troubles moteurs sur la tige, qui s'est accompagnée d'un retard dans l'apparition de la patte arrière joignant, un signe général de troubles neurologiques.

Souris infectés par la tremblante ont montré une diminution des performances de la barre horizontale à partir de la semaine 16 après l'injection, les tests rotarod à partir de la semaine 18, et les barres statiques d'au moins 19 semaines ⁸ (tests plus tôt n'a pas été effectuée). KATP canal sous-unité Kir6.2 souris KO ont été dépréciées sur les barres fixes et barres horizontales, mais pas sur la rotarod ^4. Lésions hippocampiques n'ont eu aucun effet sur ​​toute mesure de la capacité du moteur ^5, mais les souris 129S2/Sv ont été dépréciées par rapport au C57BL / 6 pression sur les tiges rotarod et statique ^3. C57BL/10 souris avaient aussi la performance du moteur pire que C57BL / 6 ^6, mais pas dans la même mesure que les souris 129S2/Sv.

Figure 1. Le rotarod.

Figure 2. Détail de la tige dentelée du rotarod.

Figure 3. Les barres horizontales tripler le bar tenu dans les encoches est la base de 2 mm; une. Cloué dessous (à des fins de démonstration uniquement) sont les barres 4 et 6 mm. Dans la pratique, une seule barre à la fois est fendue dans les supports crantés.

Figure 4. Une souris traversant une tige statique.

Figure 5. A la souris sur les barres parallèles. Rembourrage a été omis à des fins de démonstration uniquement.