Observation directe de la phagocytose et NET-formation par les neutrophiles dans les poumons infectés en utilisant deux microscopie biphotonique

Résumé

Nous montrons, comment utiliser les deux photons de microscopie pour l'observation de la dynamique des granulocytes neutrophiles dans les poumons infectés alors qu'ils phagocyter des pathogènes ou de produire des neutrophiles pièges extracellulaires (NET).

Résumé

Après le tractus gastro-intestinal, du poumon est la surface la deuxième plus grande pour l'interaction entre le corps des vertébrés et de l'environnement. Ici, un échange gazeux efficace doit être maintenue, tout en évitant en même temps l'infection par les pathogènes multiples qui sont inhalés lors de la respiration normale. Pour y parvenir, un superbe ensemble de stratégies de défense alliant humorale et cellulaire des mécanismes immunitaires existe. Une des mesures les plus efficaces pour la défense aigu du poumon est le recrutement des neutrophiles, qui soit phagocyter les pathogènes inhalés ou les tuer en libérant des produits chimiques cytotoxiques. Un ajout récent à l'arsenal des neutrophiles est leur libération explosive de l'ADN extracellulaire-NET par lequel les bactéries ou les champignons peuvent être capturés ou inactivés, même après que les cellules libérant NET sont morts. Nous présentons ici une méthode qui permet d'observer directement les neutrophiles, migrent à l'intérieur d'un poumon infecté récemment, la phagocytose des pathogènes fongiques ainsi que de visualiser le NET vaste qu'ils ont produit dans le tissu infecté. La méthode décrit la préparation des tranches épaisses de poumon viables 7 heures après l'infection intra-trachéale de souris avec des conidies de la moisissure Aspergillus fumigatus et leur examen par multicolores time-lapse 2-microscopie biphotonique. Cette approche permet d'enquêter directement sur la défense antifongique dans les tissus pulmonaires natives et ouvre ainsi une nouvelle voie pour l'investigation détaillée de l'immunité pulmonaire.

Protocole

1. Infection

1. Conidies gonflées de la moisissure Aspergillus fumigatus (souche ATCC 46645) sont générés par la pré-incubation dans du RPMI 1640 (Biochrom AG, Berlin, Allemagne) supplémenté avec 5% de FCS (v / v). 2x10 ⁷ repos conidies sont remis en suspension dans 5 ml de milieu et incubées dans une plaque à 6 puits de culture de tissu (PPT AG; Trasadingen, Suisse, catalogue # 92006) pour 7h à 37 ° C.
2. Après la période de gonflement, les spores sont marqués par fluorescence en ajoutant 10 pl de solution de calcofluor fond blanc (Sigma Aldrich, Deisenhofen, Allemagne, le numéro de catalogue F3543; [25 mg / ml] dans du DMSO) à chaque Aspergillus contenant bien dans le 6-même plaque, atteignant une concentration finale calcofluor de 50 ug / ml de RPMI. Suite à un mélange doux, les spores sont incubées pendant 15 minutes supplémentaires à 37 ° C.
3. Dans l'étape suivante, les spores sont récoltées par filtration à travers un tamis 70 cellules um (BD Biosciences, Heidelberg, Allemagne). Après un lavage une fois avec 10 ml de PBS (centrifugeuse à 900xg pendant 5 min à température ambiante), le culot est resuspendu dans 2 ml de PBS et le nombre total de conidies gonflées déterminée en comptant avec une chambre de Neubauer. Enfin, la suspension de spores sont centrifugés à 900xg pendant 5 min à température ambiante, le surnageant est soigneusement enlevé, et le culot remis en suspension à la concentration finale de 1x107 spores par 100 ul de PBS.
4. Pour l'infection, 100 pi de solution de spores est appliquée par voie intratrachéale à des souris femelles (C57/BL6, 8-10 semaines, Harlan, Allemagne). Si les neutrophiles sont à observer ainsi, l'utilisation de Lys-EGFP souris, portant EGFP sous le promoteur du lysozyme ¹ est recommandée. Commencez par anesthésier l'animal avec une injection ip unique de 150 ul Kétamine / Rompun solution (Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Allemagne (kétamine) et Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Allemagne (Rompun), 1 ml kétamine [50 mg / ml] + 0,5 ml Rompun [2%] + 3,5 ml de NaCl stérile [0,9%]). 5 minutes plus tard la souris anesthésiée peut être fixé avec une bande élastique par ses dents à la rampe (c'est à dire une surface en pente) pour faciliter l'intubation (figure complémentaire 1). En utilisant des pinces, la langue est tirée d'un côté et un cathéter veineux à demeure 22G (B. Braun AG, Melsungen, Allemagne, Vasofix Braunüle) peut être inséré doucement dans la trachée sous un éclairage permanent avec une lampe col de cygne. L'insertion réussie de la sonde est vérifiée par l'observation de mouvements réguliers du thorax de l'animal avec la fréquence de la ventilation mécanique. Lorsque l'intubation a été confirmée, la suspension 100 ul spores est appliquée à l'aide d'une micropipette 100 pi. Ce volume devrait être inhalés par l'animal sans aucune aide supplémentaire en 1-2 s. Une meilleure répartition des particules fongiques à l'intérieur du poumon est atteint par la ventilation mécanique de l'animal infecté pendant 2 minutes avec un respirateur pour petits animaux (Minivent, Hugo Sachs, Mars-Hugstetten, Allemagne) à raison de 250 respirations par minute et un volume d'inhalation de 300 ul par le souffle (figure supplémentaire 2). Après que les animaux d'infection sont retournés dans leur cage et observées toutes les 5 minutes jusqu'à ce déambulatoire à nouveau. Souris ne montrent aucun signe de douleur ou de détresse pendant la période d'incubation suivant.

2. La préparation du poumon

1. 7 h après l'infection par les spores, l'animal est euthanasié par une surdose de l'isoflurane (Baxter GmbH, Unterschleiβheim, Allemagne) jusqu'en mouvements et la respiration a cessé depuis plus de 30 secondes. Cette étape est suivie par thoracotomie comme méthode secondaire pour assurer la mort clinique et de permettre la visualisation et l'accès de la trachée et les poumons. Ensuite, le coffre est ouvert avec soin afin d'exposer les poumons et les voies respiratoires supérieures. Puis un autre cathéter 22G veineuse est insérée dans la trachée à partir de l'épiglotte exposés. Grâce à ce tubule les poumons sont remplis avec 1 ml préchauffé faible point de fusion d'agarose (2% p / v, Promega, Mannheim, Allemagne) en utilisant une seringue de 1 ml Omnifix (B. Braun). Dès que les poumons sont remplis de la trachée est lié avec un morceau court de fil à coudre et l'animal entier est mis dans un réfrigérateur à 4 ° C.
2. 15 min plus tard, quand l'agarose solidifié, tout le poumon est excisé à compter de la trachée. En utilisant une paire de ciseaux pointus, le lobe du poumon droit est ensuite retiré, la surface inférieure est brièvement séché sur une feuille de papier de soie, puis le lobe entier est collé à la préparation d'un bloc de Vibroslice vibratome (Campden Instruments, Royaume-Uni, 752m ) en utilisant une goutte de colle tissulaire pour la fixation (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Allemagne, Roti-Coll 1). Après 1 min le bloc est installé dans la chambre de coupe de l'vibratome, qui est rempli avec pré-réfrigérée (4 ° C) PBS. Le vibratome est fixé à une vibration de milieu de gamme (5 sur 10 max.) Et aussi une vitesse modérée (5 sur 10 max.) Telle que une coupe horizontale de l'poumon est produite. La moitié supérieure de l'organe est ensuite transféré dans une petite boîte de Petri en plastique (5 cm de diamètre) où elle est inversée et fixe avec une rondelle self-made-plat (1 cm de diamètre interne) qui est couvert par un ensemble de fils de nylon en parallèle, chaque mm 1 part (figure complémentaire 3). Enfin, la boîte de Pétri est rempli avec 10 ml de PBS supplémenté avec 10 pl de la teinture orange ADN Sytox [5 mm] (Invitrogen, Allemagne) résultant en une concentration finale de teinture de 5 uM.

3. Microscopie laser 2-photons

1. La boîte de Pétri contenant l'échantillon des poumons est alors installé sous l'objectif du microscope pour que le tampon peut être chauffé à 37 ° C par un capteur de température contrôlée chauffe (figure complémentaire 4). 2-microscopie biphotonique est ensuite réalisée sur la surface de coupe entière en utilisant un microscope Zeiss LSM 710 NLO debout sur une scène Axio Examiner équipé d'un objectif 20xNA1.0 l'eau plongeant (Zeiss, Jena, Allemagne). Pour l'imagerie, les différentes zones le long de la section sont numérisés jusqu'à 400 um de profondeur en utilisant une longueur d'onde de 800 nm d'illumination détecter vert (530 nm) et rouge (580 nm) de fluorescence, ainsi que la génération de second harmonique (SHG) et le signal bleue calcofluor de fluorescence (à 400-470 nm d'émission) avec des détecteurs externes non descanned (DDN). En outre images 2-D et des films laps de temps (1 image toutes les 5-10 secondes), simples ou répétitives piles image en 3 dimensions peuvent ensuite être rendu comme des rendus d'images voxels ou simple attention prolongée ou 4-D des données (3D temps) à l'aide logiciels différents. Cette configuration permet l'observation au microscope du comportement cellulaire dans un environnement presque intacte, car il constitue le port d'entrée pour une variété de pathogènes aéroportés, est d'une importance énorme immunologiques. Motilité cellulaire, la phagocytose et la production nette par les neutrophiles endogènes après infection par la moisissure Aspergillus fumigatus peuvent être facilement étudiés sous ces conditions in situ.

4. Les résultats représentatifs

Si c'est fait correctement l'imagerie va générer 2 - ou 3-couleurs des diapositives ou des films. Bien que la coloration est faite dans une procédure de post-traitement et est donc librement adaptables, nous avons généralement de sélectionner un schéma de couleurs qui reflète la couleur naturelle de la teinture / signal, qui est détectée dans le canal relatif. Ainsi, les colorants Sytox sont représentées en rouge, le champignon ainsi que le signal SHG est représentée en bleu, et, s'il est présent, EGFP cellules marquées sont colorées en vert. Dans le premier exemple (fig. 1) le signal SHG bleue représente les fibres du tissu d'un poumon non infectés et le signal rouge Sytox est produite par des noyaux de cellules pulmonaires-résident à ciel ouvert par le vibratome. Dans le second exemple (fig. 2) un poumon infecté est représenté, où les deux structures, alvéolaires ainsi que les masses fongiques, apparaissent en bleu, tandis que les noyaux et les filets sont colorés en rouge. Le troisième exemple (fig. 3) est d'un animal transgénique EGFP-Lys, où en plus des structures de bleu et rouge les neutrophiles vert peut aussi être vu. La migration des neutrophiles et leur phagocytose des éléments individuels fongique dans les séquences laps de temps est montré dans le film supplémentaire.

Figure 1. L'apparition d'une tranche de poumon non infectés dans les 2-2-couleurs microscopie biphotonique. Une tranche du poumon a été préparée à partir d'un non-infectées C57/BL6 souris et imagé comme décrit dans le protocole. Présentés ici sont le signal SHG de la structure du tissu alvéolaire (A), le signal Sytox de noyaux de cellules à ciel ouvert lors de la préparation de la tranche de poumon (B), et une superposition des deux canaux (C). La zone encadrée en (C) est vu élargi en (D). S'il vous plaît noter le tissu fibreux dans le bas du poumon tranche par rapport à l'organisation clairement alvéolaires dans les zones de respiration-active du poumon ci-dessus.

Figure 2. L'apparition d'une tranche de poumon d'un type de Aspergillus animal sauvage infecté au 2-2-couleurs microscopie biphotonique. Une tranche poumons d'une souris infectée C57/BL6 7 h avant avec A. fumigatus a été préparé et imagé comme décrit dans le protocole. Montré est la structure combinée de champignons et de SHG du tissu alvéolaire (A), le signal d'Sytox NET ADN ainsi que des noyaux de cellules à ciel ouvert lors de la préparation de la tranche de poumon (B), et une superposition des deux canaux (C) . La zone encadrée en (C) est vu élargi en (D). S'il vous plaît noter que les domaines clairement distincts des masses fongiques, alvéoles, et NET-structures sont marquées par les lettres F, A et N, respectivement.

Figure 3. L'apparition d'une tranche de poumon d'un Aspergillus infectés Lys-EGFP animal en 3-2-couleurs microscopie biphotonique. Une tranche des poumons de souris infectées Lys-EGFP 7 h avant avecA. fumigatus a été préparé et imagé comme décrit dans le protocole. Montré est la structure combinée de champignons et de SHG du tissu alvéolaire (bleu), le signal Sytox de noyaux de cellules et de NET (rouge), ainsi que ainsi que de nombreux neutrophiles (vert).

Figure complémentaires 1. Fixation de la souris pour l'intubation. Sous Kétamine / Rompun l'anesthésie de l'animal est fixé avec une bande élastique à ses dents, afin de faciliter l'intubation avec un cathéter veineux à demeure 22G.

Figure 2 supplémentaires. La ventilation mécanique de la souris. La souris intubé est infecté par une application informatique de 1x10 ⁷ spores en suspension dans 100 ul de PBS. Une meilleure répartition des particules fongiques à l'intérieur du poumon est atteint par la ventilation mécanique de la souris infectée par un respirateur de petits animaux.

Figure 3 supplémentaires. Fixation du lobe pulmonaire. Après la préparation du lobe du poumon droit de l'orgue est fixé dans une boîte de Pétri par l'utilisation d'une rondelle en laboratoire fait plat qui est couvert par un ensemble de fils de nylon parallèle.

Figure 4 supplémentaires. Configuration d'imagerie 2-photons. La boîte de Petri contenant le lobe du poumon droit est installé sur un tapis chauffant sous le microscope 2-photons après addition de l'ADN de teinture Sytox Orange.

Films supplémentaires:. Neutrophiles neutrophiles migrateurs et la phagocytose des éléments fongiques dans les poumons infectés Aspergillus tel que vu par laps de temps 2-microscopie biphotonique d'une tranche de vie pulmonaires 7 h après l'infection par le champignon sont verts, les éléments fongiques et SHG sont bleus, et des noyaux de cellules que ainsi que NET-structures sont représentées en rouge. Le temps réel de l'expérience est montré en bas à droite. La barre d'échelle représente 50 um. Cliquez ici pour visionner la vidéo

Discussion

En temps réel 2-microscopie biphotonique in vivo ou dans les organes intacts a gagné en importance profonde dans les études portant sur la physiologie des cellules immunitaires au cours des 10 dernières années. C'est avec cette technique que des événements importants tels que la dynamique de l'activation des lymphocytes T dans les ganglions lymphatiques Premières Nations devenait visible ^2-4. Plus récemment, les chercheurs ont aussi commencé à analyser des fonctions cellulaires, comme les premières étapes de la génération de cellules effectrices dans les tissus lymphatiques en utilisant cette approche ^5.

Toutefois, bien qu'un certain nombre de nouveaux concepts biologiques ont été révélés en utilisant cette méthode, il ya encore des défis et des questions importantes pour lesquelles aucun des études de visualisation intravitale ont été publiés à ce jour. Notamment cela s'applique au niveau du poumon chez les mammifères. L'aspect intéressant de cet organe, comme le port d'entrée pour une variété de pathogènes aéroportés, en fait l'une des surfaces les plus cruciaux au cours de laquelle les processus immunologiques ont lieu dans le corps des mammifères. Avec chaque respiration au cours de la durée de vie, les particules indésirables sont inhalées dont certains ont le potentiel de provoquer des infections mortelles ^6. Il est auto-explicatif que, à un tel site sensible et menacée d'un réseau serré de mécanismes de défense doit être présent présentant l'ensemble du répertoire des réponses immunitaires. D'autre part il est très important que la lutte contre les pathogènes induits immunologiques potentielles à un tel "sale" endroit est étroitement contrôlé. Réactions exagérées du système immunitaire supporter un risque élevé de nuire à son propre corps par les tissus des organes massivement blessant lors de la stimulation des cellules immunitaires non spécifiques actions ^7,8.

A la lumière de ces réflexions, il serait extrêmement intéressant et utile d'avoir la possibilité d'enquêter comportement des cellules dans les poumons des mammifères en vrai dans des conditions in vivo. Cependant, le fait qu'un tel système n'a jusqu'à présent pas été appliquée avec succès clairement les points sur les difficultés énormes qui doivent être résolus dans la mise en place d'un protocole de travail. Le défi le plus exigeant est sans doute la stabilité de discussion. Le poumon est l'organe responsable de la respiration est sous le mouvement constant dans les trois directions de l'espace pour réaliser l'inhalation. Cette seule circonstance entraîne des problèmes d'imagerie grave et peut être considéré comme un intravitale imageurs "cauchemar". Déjà un léger mouvement à toute dimension dans l'espace a un effet massif sur la détérioration de vue microscopique, qui doit être stable avec une précision micrométrique, afin de générer des images significatives ^9. Compte tenu de son orientation fondamentalement serrés locale ^10, 2-microscopie biphotonique est encore plus sensible aux instabilités de contact, comme une dislocation d'une certaine structure de l'ordre de quelques micromètres dans la direction Z est équivalent à une perte complète d'intérêt et donc une expérience ratée.

Le protocole présenté dans cette étude pour l'observation des cellules immunitaires dans les poumons de souris n'est toujours pas une application in vivo, mais plutôt un rapprochement étroit avec la situation dans un poumon fonctionnellement intactes ^11. Approches ex vivo les lymphocytes imagerie, par exemple dans la lymphe explantés nœuds, il a été démontré à donner des résultats équivalents à true dans ¹² observations in vivo et sont donc très pertinents ^5. Les observations in situ dans les tranches de poumon, qui ne sont possibles que grâce à notre approche, se déroulent dans un poumon infecté peu de temps après l'excision. L'intégrité 3D pendant le processus de coupe est assurée par la matrice d'agarose, une étape essentielle pour permettre un processus parfaitement contrôlé la coupe du poumon. Bien qu'il soit nécessaire de refroidir les poumons explantés pour une courte période afin de permettre une solidification de la matrice d'agarose, il est possible de revenir à proximité des conditions physiologiques des cellules après la coupe et le réchauffement des tissus. Ceci est clairement démontré par nos données, qui montrent que dans ces conditions neutrophiles sont très actifs et présentent leur plein potentiel comme phagocytes agiles, qui sont nécessaires pour l'apurement effectif de une infection à Aspergillus fumigatus. Ils patrouillent dans les tissus pulmonaires en passant par les barrières épithéliales en vue d'atteindre les parties intérieures des alvéoles et en outre, ils participent activement jusqu'à 11 spores fongiques. Une des principales conclusions de ce travail a été l'apparition de structures ressemblant à des neutrophiles pièges extracellulaires (EVF) dans les Aspergillus organe infecté. NET sont une conclusion très récente d'un mécanisme de défense roman dans les neutrophiles ^13. Toutefois, depuis sa première description en 2004, le nombre de conditions physiologiques ou pathologiques dans des modèles animaux ou les humains, où ce phénomène a été observé ou fait défaut a été explosive croissante ^14-16. Fait intéressant, bien que le travail tant de choses ont été consacrés à ces structures par tant de groupes différents, la plupart des rapports sont encore à un niveau très descriptive et n'est pas beaucoupsur le mécanisme de libération NET et sa régulation. Avec notre protocole, nous avons pu pour la première fois de montrer fibres NET dans un poumon infecté. Par ailleurs, nous avons pu démontrer l'importance de neutrophiles fraîchement recrutés ainsi que les structures moléculaires des champignons pour leur survenance ou l'inhibition ^11. Cela montre clairement le potentiel de notre méthode pour étudier les étapes simples de la formation des NET en détail. On pourrait penser par exemple d'utiliser les neutrophiles de souris knock-out adaptée pour observer leur capacité de formation des NET dans des expériences de transfert adoptif.

Ainsi, bien que l'observation directe de l'immigration des neutrophiles du sang périphérique n'est pas possible avec ce système à cause du manque d'approvisionnement en sang après explantation d'organe, nous croyons toujours que notre protocole est une approche précieuse et relativement facile à manipuler qui permet l'imagerie de étapes tôt ou tard dans la défense immunitaire contre les infections pulmonaires. C'est donc une étape importante vers enquête ce phénomène dans les poumons de respiration des animaux vivants.