Mesure précise et simple de la cytokine pro-inflammatoire IL-1β en utilisant un dosage de sang total Stimulation

Résumé

Nous décrivons une méthode de dosage immunologique pour mesurer la production de cytokines pro-inflammatoires, tels que la production d'IL-1 bêta, chez les patients présentant des phénotypes auto-inflammatoires. En activant les cellules dans les cultures de sang total avec des agents pathogènes motifs moléculaires associés, en particulier avec les lipopolysaccharides, la sécrétion de cytokines peuvent être facilement évaluée dans les surnageants de sang total.

Résumé

Les processus inflammatoires résultant de la sécrétion de médiateurs solubles par les cellules immunitaires, conduire à diverses manifestations dans la peau, les articulations et autres tissus ainsi que l'homéostasie des cytokines modifiées. Le système immunitaire inné joue un rôle crucial dans la reconnaissance des pathogènes et d'autres stimuli endogènes de danger. Une des principales cytokines libérées par les cellules immunitaires innées est l'interleukine (IL) -1. Par conséquent, nous utilisons un dosage sanguin de l'ensemble de stimulation afin de mesurer la sécrétion de cytokines inflammatoires et plus particulièrement de l'cytokine pro-inflammatoire IL-1β ^{1, 2, 3.}

Les patients atteints de dysfonctionnements génétiques du système immunitaire inné causant syndromes auto-inflammatoires montrent une libération exagérée de l'IL-1β matures lors de la stimulation avec le LPS seul. Afin d'évaluer la composante immunitaire inné des patients qui présentent des pathologies associées inflammatoires, nous utilisons un immunodosage spécifique pour détecter les réponses immunitaires cellulaires aux agents pathogènes motifs moléculaires associés (PAMP), tels que l'endotoxine bactérienne gram-négatif, le lipopolysaccharide (LPS ). Ces PAMPs sont reconnus par des récepteurs de reconnaissance des pathogènes (PRR), qui se trouvent sur ​​les cellules du système immunitaire inné ^{4, 5, 6, 7.} Un signal fort, LPS, en conjonction avec un signal secondaire, l'ATP, est nécessaire pour l'activation de l'inflammasome, un complexe multiprotéique que les processus pro-IL-1β à sa maturité, forme bioactive ^{4, 5, 6, 8, 9, 10.}

Le dosage sanguin de l'ensemble nécessite une manipulation minimale de l'échantillon pour évaluer la production de cytokines par rapport à d'autres méthodes qui nécessitent une isolation de main-d'oeuvre et de la culture des populations de cellules spécifiques. Cette méthode diffère des autres toute la stimulation des dosages sanguins; plutôt que de diluer les échantillons avec un ratio de RPMI médias, nous réalisons un nombre de globules blancs du sang total directement dilué et donc, de stimuler un nombre connu de globules blancs dans la culture ^2. Les résultats de ce dosage sanguin toute particulière de démontrer une nouvelle technique utile dans l'élucidation des cohortes de patients présentant des physiopathologies auto-inflammatoires.

Protocole

1. Collecte de sang total

1. Obtenir un minimum de 10 ml de sang périphérique de personnes touchées ainsi que l'âge et le sexe témoins sains appariés. Le sang veineux doit être recueilli dans des tubes Vacutainer héparine sodique collecte de sang, plutôt que d'utiliser d'autres anticoagulants tels que l'EDTA, et retourné plusieurs fois pour s'assurer bon mélange avec l'héparine de sodium. Notez que 10 ml est le volume minimum de sang total requis pour les échantillons en double plaquage pour ce dosage particulier.
2. Les échantillons doivent être traités dès que possible après le prélèvement pour obtenir les meilleurs résultats. Toutefois, le sang hépa....

Discussion

Le dosage sanguin de l'ensemble décrit est une méthode simple qui se rapproche le plus des conditions physiologiques par rapport aux autres techniques qui nécessitent l'isolement cellulaire et de traitement des échantillons vaste et la manipulation. Cette méthode utilise la Vision Cellometer avec AO pour compter les globules blancs dans le sang et fournit donc un moyen de normaliser les échantillons avec précision en fonction du nombre de cellules.

Il est à noter que pour ce test, le.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes de prélèvement sanguin au héparinate de sodium	BD Biosciences	366480
Milieu RPMI 1640	GIBCO, par Life Technologies	21870-100
Orange d'acridine	Invitrogen	A3568
Cellometer Vision	Nexcelom Bioscience		Contacter l'entreprise pour obtenir des informations sur l'appareil
Chambres de comptage Cellometer	Nexcelom Bioscience	CHT4-SD100
Plaque de culture tissulaire 24 puits	Corning	3524
LPS d'E. coli K12 ultra pur	Invitrogen	tlrl-eklps
Adénosine 5´-triphosphate, sel disodique hydraté	Sigma-Aldrich	A26209
Système Bio-plex 200	Bio-Rad		Contacter l'entreprise pour obtenir des informations sur l'appareil
Dosage x-plex Bio-Plex Pro pour cytokines humaines	Bio-Rad		Les dosages x-plex sont fabriqués sur mesure selon les cytokines spécifiées