Caractérisation des isolés, ventilés et instrumentés poumons de souris perfusées avec un flux pulsatile

Résumé

Le protocole suivant décrit le processus d'isolement, de ventilation et d'instrumenter les poumons de souris pour mesurer stable ou pulsatile vasculaire pulmonaire pression-débit des relations afin de quantifier les effets de la circulation sanguine, circulation de l'air, les changements des voies aériennes et sur les modifications vasculaires postcharge ventriculaire droite.

Résumé

Les isolés, ventilés et instrumentés préparation des poumons de souris permet constante et pulsatile vasculaire pulmonaire pression-débit relations pour être mesurée avec un contrôle indépendant sur le débit artériel pulmonaire, forme d'onde de débit, pression des voies aériennes et de la pression auriculaire gauche. La résistance vasculaire pulmonaire est calculé en fonction multi-point, une pression constante des flux courbes; impédance vasculaire pulmonaire est calculée à partir pulsatile pression-débit courbes obtenues lors d'une gamme de fréquences. Comme maintenant reconnu cliniquement, l'impédance est une mesure supérieure de la postcharge ventriculaire droite que la résistance parce qu'il inclut les effets de la compliance vasculaire, qui ne sont pas négligeables, en particulier dans la circulation pulmonaire. Trois paramètres importants de l'impédance - le zéro hertz impédance Z _0, l'impédance caractéristique Z, _C et l'indice de réflexion des ondes R _W - donnent un aperçu de distale artérielle transversale superficie disponible pour l'écoulement, la rigidité artérielle proximale et l'impédance amont-aval décalage, respectivement. Tous les résultats obtenus dans les régions isolées, ventilées et perfusées poumons sont indépendants de ton système nerveux sympathique, l'état du volume et les effets de l'anesthésie. Nous avons utilisé cette technique pour quantifier l'impact de l'embolie pulmonaire et de l'hypoxie chronique sur la résistance et l'impédance, et de différencier les sites d'action (c.-à-proximale distale vs) d'agents vasoactifs et de la maladie en utilisant la pression de la dépendance de Z _C. En outre, lorsque ces techniques sont utilisées avec les poumons des souches génétiquement modifiées de la souris, les effets de défauts au niveau moléculaire sur la structure et la fonction vasculaire pulmonaire peut être déterminée.

Protocole

Dans ce protocole, nous démontrons une isolés, aérés, la préparation perfusé des poumons de souris qui a déjà été utilisé pour quantifier l'impact de l'embolie pulmonaire et de l'hypoxie chronique sur pulsatile vasculaire pulmonaire pression-débit relations (Tuchscherer, Webster et Chesler, 2006; Tuchscherer et al ., 2007). En bref, les poumons de souris sont chirurgicalement isolés de tissus environnants, placé dans une chambre chauffée (IL-1; Harvard Apparatus, Holliston, MA) et ventilé (ventilatoire module de commande (VCM)-R avec minuterie contre Module (TCM); Harvard Appareil). La vascularisation du poumon est perfusée avec du milieu RPMI 1640 chauffée culture cellulaire avec 3,5% de Ficoll à l'aide d'une seringue électrique (Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois) pour générer les courbes de débit constant ou une pompe à haute fréquence oscillatoire (Bose-Electro force, l'Eden Prairie, MN) en parallèle avec la pompe seringue pour créer des formes d'onde pulsatile vasculaire pulmonaire débit. Capteurs de pression (P75, Harvard Apparatus) mesure la pression artérielle pulmonaire instantanée (PAP) et la pression auriculaire gauche (LAP). Débit instantané (Q) est mesuré avec un débitmètre en ligne (Transonic Systems, Inc, Ithaca, NY). Pulsatile pression-débit relations sont dérivées de ces mesures, qui donnent un aperçu vasculaire pulmonaire physiologie et la pathologie et la postcharge ventriculaire droite.

1. Equipement:

1. Pulmonaires isolés mise en place, y compris un ventilateur de souris
2. Système d'acquisition de données et l'ordinateur avec le programme LabView
3. Deux capteurs de pression et de débit Débitmètre perfusat
4. Capteur de pression et un débitmètre (pnemotachometer) pour un débit respiratoire
5. Pompe à haute fréquence oscillatoire et l'ordinateur avec le programme de test Win
6. Boom / zoom du microscope, lampe
7. Bain chauffant avec pompe à haut rendement pour le système IL-1

2. Préparer le système IL-1

1. L'eau distillée chauffée à 37 ° C par le bain de chauffage est distribué à l'intérieur de l'IL-1 du système.
2. Toutes les pompes, les capteurs et l'IL-1 canule sont connectés via un tube propre et tous les tubes sont rincés à l'eau distillée chauffée à 37 ° C. Les bulles d'air, qui pouvaient voyager dans les poumons et provoquer des oedèmes, doivent être enlevés. Tuyau de la pompe à écoulement oscillatoire au capteur de flux et du capteur de débit à la canule artérielle pulmonaire sont rincées avec du PBS 1%.
3. Le P75 transducteurs de pression sont mis à zéro par la fermeture de la vanne à la canule, l'ouverture des vannes à l'atmosphère et puis en appuyant sur le bouton à zéro automatique sur l'amplificateur PLUGSYS. Ensuite, la vanne à l'atmosphère est fermée et la vanne à la canule ouverte.
4. La pièce céramique poreuse dans la voie de ventilation du système IL-1 est mouillée de fournir l'humidité.

3. Solutions

1. Préparer 3,5% en volume de Ficoll-RPMI solution et filtre stérile dans les médias. Filtrage des médias assure qu'il n'y a pas de grosses particules qui pourraient involontairement emboliser le poumon. L'utilisation de supports stériles réduit également la probabilité de développer un œdème soudaine dans les poumons. Remplissez un seringue de 10 ml avec du RPMI pour la chirurgie et une seringue de 60 ml avec du RPMI pour chaque essai expérimental. Chauffer le perfusat dans un bain d'eau à 37 ° C.
2. Préparer 1 ml d'héparine de poids corporel 500IU/100g de la souris (approximatif). Le sel de l'héparine est 158IU/mg. Pour un ~ 25 g de souris, mélanger 1,25 mg de sel d'héparine avec 1ml de PBS solution dans un tube à centrifuger de petite taille.

4. Ventilation d'une souris

1. Après une injection intrapéritonéale de 150 mg dans une solution de pentobarbital par kilogramme dans la souris, d'assurer une anesthésie profonde en effectuant une pincée dur sur une patte. S'il n'y a pas de réaction, de préparer la souris pour la chirurgie en épinglant ses pattes avant pour liège pour la stabilité. Remarque: Tout au long de la profondeur d'anesthésie expérimentation est surveillé en observant attentivement l'animal. Les broches dans les pattes et les incisions fréquentes agissent comme des stimuli nocifs, l'absence de réponse à ce qui confirme que l'animal reste dans un plan chirurgical de l'anesthésie.
2. Vaporiser la poitrine avec de l'alcool à 95% pour mouiller le bas de la fourrure et l'utilisation de pinces droites pour saisir la peau au niveau du cou. Coupez un 1 cm d'ouverture dans la peau en utilisant les ciseaux droits.
3. Une fois l'intérieur du col est exposée, enlever tous les tissus blancs glandulaire et musculaire superficielle, à la recherche pour l'œsophage et la trachée. Isoler l'œsophage et la trachée du tissu sur les deux côtés et en arrière.
4. Insérez la pince plié sous la petite trachée et attraper un morceau de suture sur l'autre côté. Tirez le fil de suture dans la trachée et un noeud lâche chirurgiens. Ne pas serrer le fil de suture ou d'attacher le noeud.
5. Coupez un petit angle «V» dans la trachée avec de petits ciseaux; ne pas couper tout au long de la trachée. Déplacer le panneau de liège et de la souris à l'IL-1 chauffée système. En utilisant les deux pince émoussé, prenez la canule trachéale et la trachée-dessous du "V". Puis, faites glisser la canule trachéale dans la trachéotomieea par le "v" d'ouverture. Serrer le fil de suture autour trachée et canule trachéale pour sécuriser l'intérieur de la canule dans la trachée. Attacher le noeud.
6. Commencez la ventilation (50% d'inspiration, 90 cycles / min, avec une inspiration profonde) avec l'air ambiant.

5. Perfusant une souris ventilée

5.1. Accès au ventricule droit d'injecter l'héparine

1. Vaporiser la poitrine de la souris avec de l'alcool de nouveau pour mouiller la fourrure. Retirez toute la peau sur la poitrine au-dessus des côtes de l'aide de pinces et ciseaux droites droites. Coupez le haut le long du sternum. Soulever la peau de chaque côté, puis couper la peau en suivant la ligne des côtes inférieures.
2. Saisir le processus xiphoïde à la base du sternum avec des pincettes et découper un trou dans le diaphragme en utilisant les ciseaux droits. Prenez le diaphragme avec la pince à épiler et le couper loin des côtes.
3. Saisir le processus xiphoïde à nouveau avec la pince à épiler (à gauche) et utiliser la boule à pointe, des ciseaux pour couper à angle le sternum et par les côtes, en faisant attention de ne pas couper les poumons, le cœur ou les vaisseaux sanguins (utiliser le ballon à pointe sur le les ciseaux pour vous guider). Il y aura du sang mais aussi longtemps que la pointe des ciseaux est contre le sternum, le cœur et les poumons ne sera pas coupé.
4. Saisir les côtes sur le côté gauche et couper autant de côtes que nécessaire pour exposer le cœur. Injecter lentement le ventricule droit avec une solution 0,1 ml d'héparine. Cette étape est importante pour prévenir les caillots sanguins dans les poumons, qui endommagent les cellules endothéliales et nuira à la perfusion. L'héparine doit être injecté alors que le cœur bat encore.

5.2. Cathétériser l'artère pulmonaire

1. Coupez le reste des côtes (côté gauche et droit) à l'aide du dos (arrondi) fin de la pince pour pousser doucement les poumons du mur thoracique. Saisissant les poumons eux-mêmes seront endommager les tissus délicats. Contact accidentel entre les pointes de ciseaux et le tissu pulmonaire sera également causer des dommages.
2. Déplacer le microscope en place au cours du poumon. Coupez le tissu glandulaire et gras sur le dessus du cœur. Utilisez la pince à épiler pour qu'elle se détache de la artères et les veines, puis couper avec les ciseaux de printemps alors que le tissu est en tension.
3. En utilisant une autre série de pinces à épiler émoussée, écope de droite à gauche à partir du haut du coeur sous l'oreillette gauche / ventricule pour obtenir la pointe de la pince à épiler dans l'aorte et l'artère pulmonaire (AP). Pour ce faire, soigneusement qu'il ne devrait pas être la résistance à la pince à épiler. En utilisant une pince à épiler émoussée réduit la probabilité d'accident perforation de l'artère pulmonaire ou l'aorte.
4. Une fois la pointe pince est sous l'aorte et l'AP, prenez un morceau de suture et passer à travers. Faire un noeud lâche chirurgiens. Ne pas serrer le fil de suture ou d'attacher le noeud.
5. En option: utiliser les ciseaux à angle pour enlever la moitié inférieure du corps. Couper à travers les côtes et la colonne vertébrale; couper l'aorte et la veine cave va provoquer une importante quantité de sang de circuler - utiliser un Q-tip pour contenir l'écoulement. Placer dans un sac pour l'élimination.
6. Premier PA canule avec 4 ml d'une seringue de 10 ml de RPMI. Vérifier que tous les tubes est libre de bulles d'air. Perfusion du poumon avec de l'eau distillée ou des bulles se traduira par un œdème.
7. Couper une petite encoche dans la paroi ventriculaire droite libre et insérez la canule PA, visant vers le bas et vers la droite. L'extrémité de la canule doit être visible à travers la paroi transparente de l'AP. Faire infuser une petite quantité de RPMI pour confirmer votre emplacement. Serrer le fil de suture autour de la canule, l'aorte et l'AP et attacher le noeud. Notez qu'à ce stade, l'aorte est aussi liée au large afin de perfusion réelle ne doit pas commencer avant que l'oreillette gauche est canulée.

5.3. Cathétériser l'oreillette gauche

1. Couper une encoche dans la partie inférieure du ventricule gauche et l'oreillette gauche inertes (LA) canule, visant à la hausse. Une légère pression peut être nécessaire pour ouvrir la valve mitrale dans cette direction. Dans l'emplacement correct, l'extrémité de la canule se glisser à travers et être sécurisé sans suture.

5.4. Commencez la perfusion

1. Manuellement infuser RPMI de la seringue de 10 ml à 0,3 ml par minute jusqu'à ce que l'IPMB est évident dans le tuyau d'écoulement (rose-ish couleurs en contraste avec le clair PBS). S'il n'ya pas d'écoulement dans le tuyau d'écoulement, re-positionner la canule de Los Angeles. Si aucune sortie peut être obtenue avec re-positionnement, vérifier une fuite dans l'artère pulmonaire. Une fuite ou une déchirure de l'artère pulmonaire ne peut pas être réparé, ce qui est cause de l'abandon de l'expérience.
2. Connecter une seringue de 60 ml à la canule PA à travers le système IL-1 et de commencer la perfusion 1mL/min du perfusat, la vérification des fuites et en s'assurant que les poumons deviennent blancs, ce qui montre que RPMI est de remplacer le sang dans les poumons. Perfuser avec un débit lent pendant deux minutes.

6. Mesure pulsatile et Steady pulmonaire Pression-Débit relations

1. Pour les études de flux pulsatile, d'abord définir les déplacements oscillatoires piston de la pompe àles niveaux désirés pour chaque fréquence dans la WINTEST programme basé sur les expériences précédentes. Variabilité due à la structure des poumons et de la mécanique, les déplacements doivent être ajustés pour chaque souris. Réglez flux constant au niveau désiré. Ouvrez la vanne à la pompe oscillante et commencer l'enregistrement de données juste avant l'exécution du profil d'écoulement oscillatoire (programme WINTEST). Ouvrez le fichier de données et tracer le flux expérimental (Q) dans Excel. Ajuster les déplacements oscillatoires piston de la pompe à chaque fréquence (programme WINTEST) de sorte que Q max et Q min sont comme désiré.
2. Pour les essais d'écoulement stable, fermer la vanne à la pompe oscillatoire. Si cette vanne reste ouverte, la pompe oscillante agit comme un condensateur, atténuant les variations d'une débit à l'autre. Recueillir des données pour au moins 10 secondes à chaque débit ou jusqu'à ce que la pression PA ne change pas de plus de 5%.
3. Pour des mesures de flux pulsatile ou soit constante, la ventilation ancienne à une pression constante avant la collecte des données. Reprendre une ventilation immédiatement après la collecte des données.
4. Surveillez RPMI dans le tube respiratoire, ce qui est des preuves de l'œdème et est une cause de l'abandon de l'expérience. Aussi, ne laissez pas RPMI atteindre la pression des voies aériennes ou le débit des capteurs, car il pourrait endommager les capteurs.

7. Les résultats représentatifs:

Représentant Résultats Steady:

Dans le poumon isolés mise en place de l'expérimentateur a la capacité de contrôler indépendamment non seulement le débit pulmonaire Q, mais aussi les voies respiratoires LAP pression P _{de l'air} et la pression auriculaire gauche. Cela est avantageux car Q, P _air et LAP influencer le système vasculaire pulmonaire et la pression artérielle pulmonaire résultant PAP artère. Un autre avantage est que les résultats obtenus sont indépendants de ton système nerveux sympathique ^1, l'état du volume, et l'anesthésie ^2.

Changements induits par le PAP en escalier changements dans Q pour fixe P _{de l'air} et soit fixe ou variable LAP sont présentés dans la figure 1. Notez que dans la préparation pulmonaires isolées, la canule LAP est généralement relié à un tuyau qui dirige le perfusat dans un conteneur à déchets. Avec ce tube en place, le LAP est linéairement dépendante due à l'écoulement de Poiseuille Q. Cependant, la hauteur de la sortie et le conteneur à déchets peut être réglée manuellement pour fournir une constante, non nulle LAP ou le tuyau peut être enlevé pour permettre à zéro LAP qui est indépendante de Q.

Représentant Résultats pulsatile:

Bien des formes d'onde arbitraires flux pulsatile peut être générée par ce système, nous avons généralement générer des flux de la forme Q = 3 + 2 sin (2 f πt) ml / min à des fréquences de f = 1, 2, 5, 10, 15 et 20 Hz. pour évaluer l'impédance linéarisé du système vasculaire pulmonaire (Figure 2: panneau supérieur). A partir des mesures du PAP, LAP et Q qui en résulte, l'ampleur pulmonaires vasculaires impédance (Z) et de phase (θ) sont calculés d'abord en décomposant un cycle complet d'sinusoïdale AP = PAP-LAP et Q à chaque fréquence imposée de flux sinusoïdale de taux en une série de harmoniques sinusoïdales en utilisant une transformée de Fourier. Le rapport de la pression se transformer en flux de rendements de transformer l'impédance vascualar pulmonaire, PVZ = FFT (AP) / FFT (Q), qui a une magnitude de Z et de phase θ. Impédance d'entrée Z _0, impédance caractéristique _Z c, et l'indice de réflexion des ondes R _W, sont calculées à partir de l'amplitude d'impédance. En particulier, Z ₀ est calculée à partir de Z à la 0e harmonique (f = 0 Hz) en moyenne sur toutes les fréquences, Z _C est calculé comme la moyenne des Z entre le premier minimum (5 Hz) et 20 Hz, et R _W est calculée que (Z _{0-Z C)} / (Z ₀ + Z _C) ^3.

Figure 1 onde flux constant (rangée du haut) et les pressions résultant. (Deuxième rangée: PAP, P _air, LAP) en fonction du temps avec des combinaisons différentes de LAP et de _l'air P. La rangée du bas montre PAP vs Q. Dans (A) et (B), les augmentations de LAP et diminue avec Q parce que le tuyau d'écoulement est en place. Ce tube a été retiré pour (C) pour que le LAP est constante et indépendante de Q. En (D) et (E) la hauteur de la tubulure de sortie a été ajustée manuellement de sorte que le LAP est plus élevé, mais indépendante de Q. P _air était soit à fin d'inspiration (A, C, D) ou expiratoire (B, E) de pression.

Figure 2 pulsatile flux de forme d'onde Q (panneau supérieur) et les pressions résultant (panneau du bas: PAP, LAP et P _{de l'air).} En fonction du temps. A partir de ces pulsatile pulmonaires pression-débit relations, PVZ peut être calculée, ce qui reflète la postcharge ventriculaire droite totale.

Discussion

Les étapes critiques dans la chirurgie

Il est essentiel que l'on prend soin lors de la coupe de la cage thoracique loin dans les poumons. Les poumons doivent être complètement dégagées et sans entraves par les tissus environnants pendant l'inflation mais pas endommagés pendant le processus d'isolement. L'utilisation d'un objet plat comme la partie arrière de la pince peut être utilisée pour maintenir les poumons loin de la paroi thoracique afin qu'il y ait une voie clair...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringue de 1 ml	Fisher Scientific	14-829-10F
Seringue de 10 ml	Fisher Scientific	14-823-2A
Seringue de 60 ml	Fisher Scientific	13-689-8
RPMI avec GLN 6/PK	Fisher Scientific	MT10040CV
Filtres à bouchon de bouteille	Fisher Scientific	09-761-57
Ficoll PM 70	Sigma-Aldrich	F2878-100g
Héparine	Sigma-Aldrich
Y27632	Sigma-Aldrich	Y0503
Ciseaux à iris à bille coudée	Outils de science fine	14109-09
Ciseaux à ressort Vannas - Lames de 4 mm	Outils de science fine	15018-10
Ciseaux à iris fin - droit	Outils de science	fine14106-09
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35
Dumont Medical Biology Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Lauda E100 ECO-line 003	VWR international	Comparable à Lauda-Brinkmann E-103, 62400-922
IL-1 Système pulmonaire de souris perfusé isolé	Harvard Apparatus	739904
Transducteur de pression artérielle P75 pour module PLUGSYS	Appareil Harvard	730020
TS410 Modules de débit	Transonic	TS410
ME 4 PXN Precision PXN Capteurs de débit en ligne	Transonic	ME 4 PXN
Cole-Parmer Pompes multi-seringues	Cole-Parmer Cole-Parmer	EW-74900-20
Nembutal 50MG/ML 20ML Flacon	Amatheon