Translocation polarisée des protéines fluorescentes dans les Xenopus en réponse à la signalisation Wnt

Résumé

Xenopus embryonnaire ectoderme est devenu un modèle attractif pour les études de la polarité cellulaire. Un essai est décrit, dans lequel la distribution subcellulaire des protéines fluorescentes dans les cellules est évaluée ectoderme. Ce protocole aidera aborder les questions relatives au contrôle spatial de la signalisation.

Résumé

Polarité cellulaire est une propriété fondamentale des cellules eucaryotes qui est dynamiquement régulée par des facteurs intrinsèques et extrinsèques au cours développement embryonnaire ^{1, 2.} Une des voies de signalisation impliquées dans cette régulation est la voie Wnt, qui est utilisé à plusieurs reprises durant l'embryogenèse et critique pour la maladie de l'homme ^{3, 4, 5.} De multiples composants moléculaires de cette voie de signalisation coordonnée réguler de manière spatialement limité, mais les mécanismes sous-jacents ne sont pas pleinement compris. Xenopus cellules embryonnaires épithéliales est un excellent système pour étudier la localisation subcellulaire des protéines de signalisation différents. Protéines de fusion fluorescentes sont exprimés dans les embryons de Xenopus par microinjection d'ARN, des explants ectodermiques sont préparés et la localisation des protéines est évaluée par épifluorescence. Dans ce protocole expérimental, nous décrivons comment la localisation subcellulaire des Diversin, une protéine cytoplasmique qui a été impliquée dans la signalisation et la détermination de la polarité cellulaire ^{6, 7} est visualisée dans les cellules ectodermiques Xénope pour étudier la transduction du signal Wnt ^8. Coexpression d'un ligand Wnt ou d'un récepteur Frizzled modifie la répartition des Diversin fusionné avec la protéine fluorescente rouge, DP, et il recrute à la membrane cellulaire de façon polarisée ^{8, 9.} Ce protocole ex vivo devrait être un complément utile aux études in vitro des cellules mammaliennes cultivées, dans laquelle le contrôle spatial de la signalisation est différente de celle du tissu intact et est beaucoup plus difficile à analyser.

Protocole

1. Fécondation in vitro de Xenopus Oeufs

1. Obtenir œufs de grenouilles femelles qui ont été injectés avec la gonadotrophine chorionique humaine (400 unités / grenouille) 12 heures avant l'expérience.
2. Placez les oeufs dans une petite quantité (0,5-1 ml) de solution à 1 x Marc Ringer modifiée (ROR) ¹⁰ à les œufs et les féconder in vitro avec un petit morceau de testicule disséqués. Après 2-3 minutes, ajouter 0,1 x ROR pour couvrir toute la surface des œufs. En 20 minutes, l'oeuf gelée de poil est enlevé par la cystéine 3% - HCL (ajusté à pH 8 avec de l'hydroxyde de sodium). Les œufs sont lavés avec 0,1 x....

Discussion

Nous avons utilisé le protocole ci-dessus pour caractériser la localisation subcellulaire des Diversin. Dans des explants pôle animal, Diversin-DP a été détecté à côté du noyau et colocalisés avec g-tubuline, un marqueur centrosomale, dans cryocoupes (figure 1). Une fois la localisation subcellulaire d'une protéine est identifiée, les constructions de suppression peuvent être générés pour établir quels domaines protéiques sont nécessaires et suffisants pour la localisation subcellulaire. En utilisant cette approche,.......