Dans l'imagerie in vivo de la moelle épinière de souris utilisant microscopie à deux photons

Résumé

Un protocole minimalement invasive pour stabiliser la colonne vertébrale de souris et d'effectuer répétitives In vivo moelle épinière en utilisant microscopie à deux photons est décrit. Cette méthode combine un dispositif de stabilisation vertébrale et un régime d'anesthésie afin de minimiser les mouvements induits par des voies respiratoires et de produire des données d'imagerie brutes qui ne nécessitent pas d'alignement ou d'autres post-traitement.

Résumé

L'imagerie in vivo en utilisant microscopie à deux photons dans ^une souris qui ont été génétiquement modifiées pour exprimer des protéines fluorescentes dans des types cellulaires ^2-3 a sensiblement élargi notre connaissance des processus physiologiques et pathologiques dans de nombreux tissus in vivo ^4-7. Dans les études sur le système nerveux central (SNC), il ya eu une large application de l'imagerie in vivo dans le cerveau, qui a produit une pléthore de nouvelles et les résultats souvent inattendus sur le comportement des cellules comme les neurones, les astrocytes, la microglie, sous conditions physiologiques ou pathologiques ^8-17. Toutefois, des complications essentiellement techniques ont limité la mise en œuvre de l'imagerie in vivo dans des études de la moelle épinière de souris vivante. En particulier, la proximité anatomique de la moelle épinière vers les poumons et le cœur génère des artefacts importants mouvements qui permet l'imagerie de la moelle épinière qui vivent une tâche difficile. Nous avons développé une nouvelle méthode qui permet de surmonter les limitations inhérentes à l'imagerie de la moelle épinière par la stabilisation de la colonne vertébrale, réduisant respiratoires induites par les mouvements et en facilitant ainsi l'utilisation de la microscopie à deux photons à l'image de la moelle épinière de souris in vivo. Ce résultat est obtenu en combinant un dispositif de stabilisation spinale personnalisé avec une méthode d'anesthésie profonde, résultant en une réduction significative des maladies respiratoires induites par les mouvements. Ce protocole vidéo montre comment exposer une petite zone de la moelle épinière qui vivent peut être maintenu sous des conditions physiologiques stables sur de longues périodes de temps en gardant une lésion des tissus et des saignements au minimum. Représentant des images brutes acquises en détail in vivo à haute résolution de la relation étroite entre les microglies et la vascularisation. Une séquence timelapse montre le comportement dynamique des processus microgliales dans la moelle épinière de souris vivante. Par ailleurs, une analyse continue de la même z-cadre démontrents la stabilité exceptionnelle que cette méthode peut réaliser pour générer des piles d'images et / ou des films timelapse qui ne nécessitent pas d'alignement d'image post-acquisition. Enfin, nous montrons comment cette méthode peut être utilisée pour revisiter et réimager la même zone de la moelle épinière au timepoints plus tard, permettant des études longitudinales de cours de processus physiologiques ou pathologiques in vivo.

Protocole

1. Construire le dispositif de stabilisation spinale

1. Ordre de la mission STS-A Narishige Compact Pinces moelle épinière et le Narishige MA-6N adaptateur tenant la tête.
2. Conception sur mesure et faire une plaque en acier inoxydable de base pour tenir les deux parties Narishige dans l'alignement de sorte que la tête de l'animal est pris en charge alors que sa colonne vertébrale et la queue sont serrées. Gardez à l'esprit que l'ensemble du dispositif doit pouvoir être placés sous l'objectif du microscope généralement sur une platine de microscope abaissé.

2. La chirurgie des animaux

1. Pré-chauffer la chamb....

Discussion

La méthode décrite ici permet de stable et répétitive en imagerie in vivo de la fluorescence densément peuplées structures cellulaires dans la moelle épinière des souris anesthésiées à l'aide microscopie à deux photons. La stabilité obtenue est le résultat d'un instrument fait sur mesure et une stabilisation de la colonne vertébrale protocole anesthésique qui réduit d'artefact mouvement respiratoire induite. Le dispositif de stabilisation vertébrale permet de répit sous le corps de la souri.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires
Rhodamine B dextrane	Invitrogen	D1841	70 kDa, dilué dans ACSF (3% p / v)
Kétamine HCl	Bionichepharma	NDC Non: 67457-001-10	Injectable, 50mg/ml
Anased	Lloyd Labs	NADA Non: 139-236	Injectables xylazine, 20mg/ml
Acépromazine	Vedco	NADA Non: 117-531	Injectable, 10mg/ml
Les larmes artificielles onguent	Phoenix pharmaceutiques	NDC Non: 57319-760 - 25	Lubrifiant
Betadine	Fisher	19-061617
McPherson Westcott Ciseaux	Précision du Monde Instruments	555500S	Courbé, émoussé pointe ciseaux
Pince droite	Précision du Monde Instruments	555047FT	Pince la pointe crantée
Petit bâtiment cautériser	Outils Fine Science	18000-00
Gelfoam	Pharmacia, Pfizer Inc	Mixer Mill MM400
Compact de la moelle épinière pinces	Narishige	STS-A
Adaptateur de tête tenant	Narishige	MA-6N
Gelseal	Amersham Biosciences Corp	80-6421-43
Ringer	Baxter Healthcare	2B8609
Buprenex	Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc	NDC Non: 12496 - 6757-1	La buprénorphine, injectables
Baytril	Bayer	NADA 140-913	Enrofloxacine, injectable antibactérien 2,27% (20ml)
Coussin chauffant - Grand	Outils Fine Science	21060-10