Préparation de vie isolées cellules photoréceptrices vertébrés pour l'imagerie de fluorescence

Résumé

Une méthode est décrite pour la préparation des cellules photoréceptrices de vie simple de différentes espèces de vertébrés pour l'imagerie de fluorescence. La méthode peut être utilisée pour l'image de la fluorescence des fluorophores endogènes, tels que le NADH ou la vitamine A, ou celle de manière exogène ajouté des colorants fluorescents sensibles à Ca ^{2 +} Ou d'autres facteurs.

Résumé

Dans la rétine des vertébrés, phototransduction, la conversion de la lumière en un signal électrique, est effectué par la tige et le cône cellules photoréceptrices ^1-4. Rod photorécepteurs sont responsables de la vision dans la pénombre, des cônes de lumière. Phototransduction prend place dans le segment externe de la cellule de photorécepteur, un compartiment spécialisé qui contient une forte concentration de pigment visuel, le détecteur de lumière primaire. Le pigment visuel est composé d'un chromophore, 11 - cis rétinal, attaché à une protéine, l'opsine. Un photon absorbé par le pigment visuel isomérise le chromophore de 11 - cis-trans. Cette photoisomérisation provoque un changement conformationnel dans le pigment visuel qui déclenche une cascade de réactions aboutissant à un changement dans le potentiel de membrane, et entraînant la transduction du stimulus lumineux en un signal électrique. La reprise de la cellule de la stimulation lumineuse implique la désactivation des intermédiaires activés par la lumière, et le rétablissement du potentiel de membrane. Ca ^{2 +} module l'activité de plusieurs enzymes impliquées dans la phototransduction, et sa concentration est réduite lors de la stimulation lumineuse. De cette façon, le Ca ^{2 +} joue un rôle important dans le rétablissement de la cellule de la stimulation lumineuse et son adaptation à la lumière de fond.

Une autre partie essentielle du processus de récupération est la régénération du pigment visuel qui a été détruit pendant la lumière de détection par le photoisomérisation de ses 11 - chromophore cis-trans ^5-7. Cette régénération commence par la libération de tous les trans-rétinienne par le pigment photoactivé, laissant derrière lui l'opsine apo-protéines. Les libérés tout-trans rétinal est rapidement réduit dans une réaction en utilisant le NADPH au rétinol tout trans, et se combine avec l'opsine 11 frais - rétinien cis introduits dans le segment externe pour réformer le pigment visuel. Tous les trans-rétinol est alors transférée hors du segment externe et dans les cellules voisines par la protéine porteuse rétinoïdes Interphotoreceptor spécialisés de reliure (IRBP).

L'imagerie de fluorescence des cellules photoréceptrices unique peut être utilisée pour étudier leur physiologie et biologie cellulaire. Ca ^{2 +} sensibles colorants fluorescents peuvent être utilisés pour examiner en détail l'interaction entre les segments externes Ca ^{2 +} et les changements réponse à la lumière ^{de 8 à 12} ainsi que le rôle du segment intérieur de Ca ^{2 +} magasins dans l'homéostasie du Ca ^{2 + 13,14} . Les colorants fluorescents peuvent également être utilisés pour mesurer la concentration en Mg ^{2 + 15,} le pH et comme traceurs de compartiments aqueux et la membrane ^16. Enfin, la fluorescence intrinsèque des tout-trans rétinol (vitamine A) peuvent être utilisés pour suivre la cinétique de sa formation et l'élimination des cellules photoréceptrices seule ^17-19.

Protocole

1. Préparation de Sylgard couverts vaisselle, chambres expérimentales, et les lames de rasoir

1. 35 mm Falcon boîtes de Pétri recouvert d'élastomère Sylgard sont nécessaires pour le bon à découper une rétine isolée d'obtenir des cellules photoréceptrices unique. L'élastomère est préparé selon les instructions du fournisseur et une petite quantité est versé dans chaque plat pour couvrir le fond avec une couche. Remplacer le plat couvre après le revêtement et les stocker. Dans quelques jours, «l'élastomère durcit et les plats sont prêts.
2. Photorécepteurs isolés besoin de coller au fond de la chambre expérimentale de sorte qu'ils sont immobilisés au cou....

Discussion

Si la santé des cellules isolées ne sont pas obtenus, le problème réside soit avec l'isolement ou la santé de la rétine ou avec son hachage. Généralement, après avoir enlevé le devant de l'œil et le corps vitré, la rétine ascenseurs facilement hors de l'épithélium pigmentaire. Si ce n'est pas, essayez de le retirer à partir de la périphérie de l'œilleton. S'il est encore difficile de séparer, une possibilité probable est que l'animal n'a pas été adaptés à l'obscurité pendant une pério.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom	Société	Numéro de catalogue	Commentaires
Chambre noire (100-150 pi 2)
Les feux rouges 19			Les magasins en ligne
Sources de lumière infrarouge et les téléspectateurs d'images infrarouges	FJW Optical Systems, Inc
Loupe binoculaire 19			Muni de téléspectateurs à infrarouge
Microscope à épifluorescence enfermé dans une cage étanche à la lumière 19
Des outils de dissection (ciseaux, pinces, porte-lame)	Roboz ou Outils Fine Science
Élastomère Sylgard	Essex (Charlotte, Caroline du Nord)	Kit Sylgard élastomère 184
Poly-L-ornithine (0,01%)	Sigma-Aldrich	P4957
Poly-L-lysine (0,1%)	Sigma-Aldrich	P8920	Diluer à 0,01%
Chambres expérimentales	Warner Instruments (Hamden, CT)	D3512P
Boîtes de Pétri, pipettes en plastique	Fisher Scientific