Research Article
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Cet article décrit une
La dissémination métastatique des cellules malignes nécessite une dégradation de la membrane basale, la fixation des cellules tumorales à l'endothélium vasculaire, la rétraction des jonctions endothéliales et, enfin, l'invasion et la migration des cellules tumorales dans la couche endothéliale à pénétrer dans le sang en tant que moyen de transport à des sites distants chez l'hôte 1-3. Une fois dans le système circulatoire, les cellules cancéreuses adhèrent aux parois capillaires et s'extravaser aux tissus environnants pour former des tumeurs métastatiques 4,5. Les différentes composantes de l'interaction cellulaire des cellules endothéliales tumorales peuvent être reproduits in vitro en contestant une monocouche de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) avec des cellules cancéreuses. Les études réalisées avec la microscopie électronique et à contraste de phase suggèrent que la séquence dans in vitro des événements représentent fidèlement le processus métastatique in vivo 6. Ici, nous décrivons une technique basée électrique impédance qui surveille et quantifie en temps réel les invasionique des cellules endothéliales par les cellules tumorales malignes.
Giaever et Keese décrit d'abord une technique de mesure des variations de l'impédance quand une population de cellules se développent à la surface des électrodes 7,8. L'instrument de xCELLigence, fabriqué par Roche, utilise une technique similaire pour mesurer les changements d'impédance électrique que les cellules se fixent et se répandent dans une boîte de culture recouvert d'une matrice de microélectrodes d'or qui couvre environ 80% de la surface au fond d'un puits. Comme les cellules se fixent et se propagent à la surface de l'électrode, elle conduit à une augmentation de l'impédance électrique 9-12. L'impédance est affiché en tant que paramètre appelé cellule d'indice sans dimension, qui est directement proportionnelle à la surface totale de culture de tissu et qui est recouverte par les cellules. Ainsi, la cellule-index peut être utilisé pour contrôler l'adhérence des cellules, d'étalement, de la morphologie et de la densité des cellules.
Le dosage de l'invasion décrit dans cet article est basé sur des changementsl'impédance électrique au niveau de l'électrode / cellule en interphase, en tant que population de cellules malignes envahir par une monocouche HUVEC (Figure 1). La perturbation des jonctions endothéliales, la rétraction de monocouche endothéliale et le remplacement par des cellules tumorales conduit à de grandes variations d'impédance. Ces modifications sont en corrélation directe avec la capacité invasive des cellules tumorales, à savoir, d'une invasion par des cellules très agressifs conduisent à de grandes variations de l'impédance de la cellule et vice versa. Cette technique permet un double avantage par rapport aux méthodes existantes de mesure invasion, tels que chambre de Boyden et analyses matrigel: 1) l'interaction cellulaire des cellules tumorales endothéliales imite de plus près le procédé in vivo, et 2) les données sont obtenues en temps réel, temps et est plus facilement quantifiable, par opposition à l'analyse des paramètres pour d'autres méthodes.
1. Préparation
2. Génération HUVEC monocouche
3. Addition des cellules et la normalisation des données d'invasion.
4. Les résultats représentatifs:
Un exemple de HUVEC monocouche invasion par les cellules métastatiques et non métastatiques est illustré à la figure 3. K7M2 est une lignée de cellules d'ostéosarcome métastatique. Ces cellules expriment des niveaux élevés de l'Ezrin de protéines de liaison du cytosquelette, ce qui explique les propriétés invasives de cette lignée cellulaire 13,14. Lorsque les cellules HUVEC sont mis au défi avec des cellules K7M2, il ya une baisse de la résistance électrique dans les 6 heures. Cette baisse de résistance électrique représente l'invasion de la monocouche HUVEC par les cellules tumorales envahissantes. La lignée cellulaire K12, d'autre part, exprime des niveaux beaucoup plus faibles de Ezrin et est par conséquent moins métastatique 13. Contestation de la monocouche HUVEC avec K12 cellules entraîne une baisse moins forte de la résistance que les cellules sont incapables d'adhérer ou envahir par la monocouche HUVEC (Figure 3).
Figure 2. Formation de la monocouche HUVEC. Les variations de l'indice de la cellule que les cellules HUVEC s'attacher et se propagent sur des électrodes d'or recouvertes de gélatine. La formation d'une monocouche confluente est représentée par une stabilisation de l'indice de cellules après 18 heures.
Figure 3. Invasion des cellules HUVEC par K7M2 et K12 cellules d'ostéosarcome. Une forte diminution de cell-indice survient en quelques heures de la mise en place de cellules hautement métastatiques K7M2. Cellules K12, en revanche, sont moins métastatique et sont incapables de pénétrer la monocouche endothéliale aussi efficacement que les cellules K7M2. Ceci est représenté par une moins forte baisse de l'indice de la cellule lorsque la monocouche HUVEC est contestée par des cellules K12. Contrôle représente l'impédance de monocouche HUVEC en l'absence de cellules cancéreuses. Des expériences ont été réalisées en triple.
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Ce travail a été généreusement financé par des fonds de la Fondation du cancer (Baltimore, MD), Brandon Lee Carrington Foundation (Silver Spring, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137) et le NIH pour enfants (R01CA108641).
Nous tenons à remercier le Dr Anton Wellstein et les membres de son laboratoire pour partager leur expérience et nous aider à optimiser les méthodes présentées.
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