Vibratome sectionnement pour la préservation accrue de la cytoarchitecture de l'Organe de Corti des mammifères

Résumé

Une procédure simple de vibratome sectionner l'organe de Corti, suivie par microscopie confocale immunohistochimie et est décrit. Cette procédure permet une meilleure conservation de l'cytoarchitecture amende de l'organe de Corti des mammifères, et permet par conséquent d'une quantification précise des types de cellules.

Résumé

L'organe de Corti des mammifères est une mosaïque très ordonné cellulaires de cheveux et de mécano nonsensory cellules de soutien
(Examiné en ^1,2). Visualisation de cette mosaïque cellulaires exige souvent que l'organe de Corti est à section. En particulier, le pilier nonsensory et les cellules de Deiters, dont les noyaux sont situés basale à l'égard des cellules ciliées, ne peuvent être visualisées sans coupes transversales de l'organe de Corti. Toutefois, la cytoarchitecture délicat de l'organe de Corti des mammifères, y compris les processus cytoplasmiques fines du pilier et les cellules de Deiters, est difficile à conserver par la routine des procédures histologiques telles que la paraffine et cryo-coupe, qui sont compatibles avec les techniques standards de coloration immunohistochimique.

Je décris ici une procédure simple et robuste composé de vibratome sectionnement de la cochlée, la coloration immunohistochimique de ces sections vibratome dans la montagne entière, suivie par microscopie confocale. Cette procédure a été largement utilisée pour l'analyse immunohistochimique de multiples organes, y compris le bourgeon de membre de la souris, le poisson-zèbre intestins, le foie, le pancréas et le cœur (voir ^3-6 pour des exemples choisis). En outre, cette procédure a été réussie pour les deux imagerie et quantitificaton du nombre de cellules dans les organes des piliers de mutants et de contrôle de Corti à la fois dans les embryons et des souris adultes ^7. Cette méthode, cependant, n'est pas largement utilisée pour examiner l'organe de Corti des mammifères. Le potentiel de cette procédure à la fois à assurer la préservation accrue de la cytoarchitecture amende de l'organe de Corti et les adultes permettent de quantifier les différents types de cellules est décrite.

Protocole

1. L'isolement et la fixation de l'oreille interne

1. Pour l'analyse de la structuration cellulaire dans l'organe de Corti, euthanasier correctement mis en scène des embryons ou des adultes.
2. Disséquer la capsule otique, contenant de l'oreille interne membraneuse. Chez la souris, ce qui peut être facilement fait sur les embryons au embryonnaires (E) 14,5 jours et plus, dont E 0,5 est le jour où un bouchon vaginal a été détectée. La dissection de la capsule otique est accompli d'abord par la décapitation et l'ouverture du crâne à la ligne médiane. Retirer du cerveau afin d'exposer chaque oreille (Fig. 1A). Oreille interne peut être déboursé intacte pi....

Discussion

La procédure de sectionnement vibratome, suivi par imagerie confocale immunohistochimie et permet la visualisation de l'organe de Corti à une lésion tissulaire minime. De toute évidence, les images prises à partir confocale régions internes dans la section vibratome montrent une excellente conservation de la morphologie cellulaire qui n'est limitée que par des artefacts de fixation. Images prises confocale à proximité des deux coupe-surfaces d'une section vibratome sont souvent impossibles à distinguer des i.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Leica VT1000S lame vibrante microtome	Leica
Zeiss LSM510 microscope confocal à balayage laser	Zeiss
Étudiant Dumont # 5 forceps	Outils Fine Science	91150-20
UltraPure bas point de fusion d'agarose	Invitrogen	16520-050
Moisissures intégration Peel-A-Way	Polysciences	18986 ou 18646A
l'albumine sérique bovine	Jackson ImmunoResearch	001-000-162
Sérum de chèvre	Invitrogen	16210-064
S100	Dako	Z0311
Alexa Fluor 568 de chèvre anti-IgG de lapin	Invitrogen	A-11036	Dilution de 1:1000
Vectashield	Vector Labs	H-1000
YO-PRO-1	Invitrogen	Y3603
graisse à vide	Fisher	S41718
Affi-Gel Blue Gel	Bio-Rad	153-7301