Ce support entière In situ décrit les étapes essentielles qui assurent des résultats reproductibles de haute qualité pour les études d'expression génique dans des embryons de jour E8.5-E11.5 vieille souris.
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Article de méthode
Whole mont In Situ de E8.5 à E11.5 embryons de souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
Monter toute l'hybridation in situ est une approche très instructive pour définir les profils d'expression génique dans des embryons. L'hybridation in situ dans les procédures sont longues et techniquement exigeant avec plusieurs étapes importantes qui contribuent collectivement à la qualité du résultat final. Ce protocole décrit en détail plusieurs étapes clés de contrôle de qualité pour l'étiquetage de sonde d'optimisation et de performance. Globalement, notre protocole fournit une description détaillée des étapes critiques nécessaires pour obtenir des résultats reproductibles de grande qualité. Premièrement, nous décrivons la génération de digoxygénine (DIG) des sondes ARN marqués par transcription in vitro de matrices d'ADN générés par PCR. Nous décrivons trois critiques des tests de contrôle qualité pour déterminer le montant, l'intégrité et l'activité spécifique de la DIG sondes marquées. Ces étapes sont importantes pour générer une sonde d'une sensibilité suffisante pour détecter des ARNm endogène dans un embryon de souris ensemble. En outre, nous décrivons les méthodes de fixation et le stockage d'embryons jour E8.5-E11.5 vieille souris pour l'hybridation in situ. Ensuite, nous décrivons des méthodes détaillées pour limiter la protéinase K digestion des embryons réhydratés suivie par les détails des conditions d'hybridation, lavages post-hybridation et le traitement RNase pour enlever hybridation de sonde non spécifique. Un anticorps AP-conjugué est utilisé pour visualiser la sonde marquée et de révéler le profil d'expression de la transcription endogène. Résultats représentatifs sont présentés à partir d'expériences réussies et les expériences typiques sous-optimale.
Protocole
1. La génération intermédiaire ribosonde transcription in vitro
- Préparation des produits de PCR dans des modèles de transcription in vitro.
- Conception des amorces PCR avec des séquences promotrices de la transcription dans le phage leurs extrémités 5 '.
Remarque: La séquence du promoteur ajouté à l'extrémité 5 'de l'amorce sens brin PCR sera utilisée pour transcrire la sonde sens, et la séquence du promoteur ajouté à l'extrémité 5' de l'amorce antisens PCR sera utilisée pour synthétiser la sonde anti-sens 1-3. Nous n'avons détecté aucune différence dans l'efficacité de transcript....
- Conception des amorces PCR avec des séquences promotrices de la transcription dans le phage leurs extrémités 5 '.
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Discussion
Les méthodes décrites dans ce protocole ont été adaptés à partir d'un certain nombre de sources différentes et optimisé pour le montage toute E8.5-E11.5 embryons de souris âgés jour. Méthodes de montage toute l'hybridation in situ des embryons de vertébrés est apparu au début des années 1990 2,5-12. Ce protocole a été adapté principalement à partir des méthodes développées pour les embryons de Xénope 7,8 ainsi que la souris 2,11. Dans notre protocole beaucoup d&.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH R21MH082360 (BGC) et R01HD056315 (GRN), ainsi que l'Université de Géorgie.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires | |
|---|---|---|---|---|
| Nom | Tapez | Société | Numéro de catalogue | Commentaires |
| Digoxigénine-11-uridine-5'-triphosphate | Réactifs | Roche | 11209256910 | |
| Réglez Triphosphate ribonucléoside | Réactifs | Roche | 11277057001 | |
| Colonnes Spin rapide pour la purification d'ARN radiomarqué | Alimentation | Roche | 11274015001 | |
| T7 RNA polymérase | Réactifs | Roche | 10881767001 | |
| SP6 ARN polymérase | Réactifs | Roche | 10810274001 | |
| T3 ARN polymérase | Réactifs | Roche | 11031163001 | |
| CTP, [α-32P] - 800Ci/mmol 10mCi/ml, 250 pCi | Réactifs | Perkin Elmer | BLU008X250UC | |
| DNase I recombinante, sans RNase | Réactifs | Roche | 4716728001 | |
| Urée, incolore à blanc cristaux ou poudre cristalline | Réactifs | Fisher | BP169-500 | |
| Tampon de chargement de gel | Réactifs | Ambion | AM8547 | |
| Hybond-N +, Amersham | Alimentation | GE Healthcare | RPN82B | |
| UV Stratalinker 2400 | Équipement | Stratagene | ||
| Diéthyl pyrocarbonate | Réactifs | Sigma | D5758-100ML | |
| Héparine sodique | Réactifs | Acros | 41121-0010 | |
| peroxyde d'hydrogène à 30% dans de l'eau | Réactifs | Fisher Scientific | BP2633-500 | |
| Glutaraldéhyde, 8% de grade EM | Réactifs | Polysciences | 0 / 710 | À utiliser avec prudence selon les instructions du fabricant |
| Réactif de blocage | Réactifs | Roche | 11096176001 | Faire en stock 5% et conserver à -20 ° C |
| Protéinase K | Réactifs | Roche | 3115852001 | |
| RNase A | Réactifs | Roche | 10109142001 | Faire que 10 mg / ml d'actions et de stocker à -20 ° C. |
| RNase T1 | Réactifs | Roche | 10109193001 | |
| Ultrapure Formamide | Réactifs | Invitrogen | 15515-026 | |
| Chlorhydrate de lévamisole | Réactifs | ICN Biomedicals. Inc | 155228 | |
| L'acide ribonucléique de la levure Torula, type VI | Réactifs | Sigma | R6625 | phénol / chloroforme extrait plusieurs fois et précipité, remis en suspension dans DEPC dH2O et conservés à -20 ° C |
| Anti-digoxigénine-AP fragments Fab | Réactifs | Roche | 11093274910 | |
| BM Violet AP Substrat, précipitant. Prêt-à-l'emploi. | Réactifs | Roche | 11 442 074 001 | |
| 4 ml, transparent, fermé Top, Kit commodité de stockage Vial | Alimentation | Scientifique nationale | B7800-2 | |
| Shake N four à hybridation Cuire | Équipement | Boekel Scientific | 136400 | |
| Biopsie Sure-Tek | Alimentation | Fisherbrand | 15 à 200-402C | |
| Paraplast plus le milieu tissulaire intégration | Réactifs | Fisherbrand | 23-021-400 | |
| Peel-A-Way jetables en plastique moules intégration tissulaire | Alimentation | Polysciences | 18646A | |
| Microscope diapositives Colorfrost plus | Alimentation | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Nucléaire Rouge Rapide | Réactifs | Sigma | N8002 | |
| Cytoseal 60 | Réactifs | Richard-Allan scientifique | 8310-16 |
Références
- Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization. J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).
- Wilkinson, D. G., Nieto, M. A.
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Réimpressions et autorisations
