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1. L'inoculation de la tumeur dans le CAM d'embryon aviaire
- Préparer sans coquille des embryons de poulet fécondés comme décrit 8.
- Le 9 ème jour de développement embryonnaire, assembler un micro-injecteur à l'aide d'une aiguille de calibre 18 connectés sur seringue de 1 mL. Coupez un morceau de tuyau 5-6 pouces Tygon (1 / 32 "de diamètre, 3 / 32" de diamètre extérieur, 1 / 32 "épaisseur de paroi) et insérer délicatement l'aiguille de biseau de dans le tube. Environ 4-5 cm de tubulure doit s'étendent de la pointe de l'aiguille (figure 1a).
- Remplir la seringue et le tube avec la suspension cellulaire. Ensuite, insérer une aiguille de verre micro-injection à l'extrémité du tube et enlever soigneusement les bulles d'air.
- Injecter Jour 9 embryons (figure 1b) sous un champ de dissection d'un illuminateur d'10,000-100,000 cellules cancéreuses en bolus dans le CAM (figure 1c). Lentement injecter des cellules et soigneusement s'assurer que l'aiguille est dans le bon endroit pour les cellules de former un bol visibles au sein de la CAM. Les cellules qui dégoutte sur la surface de came peuvent être nettoyés en utilisant l'applicateur Kimwipe ou autres.
- Retour aux embryons incubateur humidifié à 38 ° C avec une humidité de 60% et permettre la tumeur de croître et vasculariser (jusqu'à 7 jours).
2. Préparation de nanoparticules
- Pour préparer marqué par fluorescence des nanoparticules CPMV pour l'injection dans l'embryon de poulet; diluer les nanoparticules virales (synthétisé comme en 8 dans du PBS, pH 7,4, à une concentration du mélange Vortex 100 pg / ml avant de l'utiliser et centrifuger pendant une minute pour enlever tout. agrégats. sonication peut également être utile en fonction de conjugués et le degré d'agrégation. Stocks de CPMVs marqué par fluorescence sont stables pendant au moins 1 an s'il est conservé à 4 ° C dans l'obscurité. Vérifiez périodiquement stocks en mettant quelques gouttes sur une lame de verre et la vérification pour la fluorescence. Transmission Electron Microscopy (TEM) peuvent également être utilisés pour déterminer si les particules restées intactes après conjugaison.
- En bref, un microgramme de nanoparticules virales (dans un volume final de 2 pl) peuvent être ajoutés à des grilles de cuivre enrobées. Ensuite, ajoutez un volume égal d'acétate d'uranyle 2% pendant 1 minute à microscope électronique (Philips EM 410).
3. L'injection intraveineuse d'marqués à la fluorescence des nanoparticules virales
- Le Jour 16, assembler des micro-injecteur tel que décrit ci-dessus. Aspirer le volume désiré de nanoparticules virale à travers le tube dans la seringue (> 200 uL). Retirez délicatement les bulles d'air. Insérez l'aiguille de verre micro-injection à l'extrémité du tube. Assurez-vous que l'aiguille est plus longue et effilée que possible (figure 2a). Si l'aiguille est trop brutal, il ne sera pas en mesure de percer l'ectoderme et ne parviendra pas à pénétrer dans le bateau. Si l'aiguille est trop forte, la pointe va s'effondrer lors de la pénétration tissulaire.
- Intraveineuse injecter 100 ml de dextran 1 mg / ml de fluorescéine (MW 70000 Da, Invitrogen) en portant une tumeur embryonnaire distale du site désiré pour être visualisées (figure 3d). Canulation veineuse réussie de CAM est évident par la compensation de sang dans le chemin du débit d'injection (Figure 2b). Évaluer vasculaires fuites 1 heure après l'injection.
- Par voie intraveineuse d'injecter 50 ul de 1 mg / ml, solution de CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-AF 647) ou pégylé CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-PEG-AF 647) dans des embryons contenant les tumeurs avec fuite vasculaire distale du site désiré être visualisées.
- Tumeurs Image immédiatement et toutes les heures après l'injection en utilisant un Zeiss examinateur Z1 microscope droit équipé d'un disque Yokogawa filature, Hamamatsu Imagem 9100-12 EM-CCD.
4. En temps réel d'imagerie intravitale
- Pour assembler l'unité d'imagerie embryon, appliquer une mince couche de graisse à vide autour de la circonférence du port d'imagerie sur le dessous du couvercle de l'unité d'imagerie embryon, et en forme une lamelle de verre de 18 mm sur le port.
- Position de l'embryon de telle sorte que la lamelle couvre la zone souhaitée pour l'imagerie. Abaissez lentement le couvercle jusqu'à ce que la lamelle est tout simplement le contact avec l'embryon, puis vissez le couvercle sur l'appareil pour le maintenir en place (figure 2c).
- Ajouter de l'eau chauffée à 37 ° C dans l'unité d'imagerie embryon en dehors du plat contenant l'embryon, puis placez l'unité entière sur la scène d'un microscope confocal à droite avec la chambre de l'intérieur de l'environnement équilibré à 37 ° C.
- Positionnez l'unité d'imagerie contenant l'embryon au microscope à fluorescence confocale à disque rotatif (figure 2e). L'unité d'imagerie tiendra l'embryon en place et tenir le champ de vision tout en capturant des images fixes, permettant à la fois des piles Z en trois dimensions et time-lapse de capturer des images. Nous acquérir et d'analyser en trois dimensions time-lapse images à l'aide de Perkin Elmer (anciennement Improvisation) logiciel Volocity (figure 3a). Acquérir une haute résolution en trois dimensions pile de la tumeur et les vaisseaux environnants pour visualiser detaileanalyses d structurelles spécifiques au temps des points. Acquérir en trois dimensions des piles à intervalles réguliers de temps aux points de carte détaillée des changements structurels dans la vascularisation tumorale. Tumeurs image toutes les heures après l'injection.
- Quantifier l'absorption des nanoparticules virales en calculant la moyenne Alexa Fluor (AF) 647 du signal dans des régions sélectionnées dans la tumeur ou dans le stroma (non tumoral région) en utilisant le logiciel d'image telles que la quantification Volocity (Perkin Elmer). La tumeur du stroma ratio a été calculé en divisant la moyenne AF 647 du signal dans la tumeur sur la moyenne du signal AF 647 dans le stroma. Un ratio tumeur / stroma supérieur à 1 indique que la nanoparticule est repris par la tumeur.
5. Les résultats représentatifs:
Dans l'exemple décrit ici, nous avons injecté des cellules HT-29 du cancer du colon pour former un bolus d'environ 1mm dans la taille au sein de la CAM d'embryons de poulet jour 9 (figure 1b). Après inoculation, les embryons ont été cultivés pendant 7 jours dans un incubateur humidifié pour permettre la croissance tumorale et la vascularisation suffisante (figure 1c). Les embryons ont été injectés par voie intraveineuse avec un faible poids moléculaire du dextrane de confirmer la vascularisation tumorale, et les tumeurs ont été visualisées au microscope Zeiss Z1 AxioExaminer verticale (figure 2d).
Après administration intraveineuse de CPMV-AF 647 ou CPMV-PEG-AF 647 nanoparticules (figure 3a et b), à haute résolution en temps réel l'imagerie confocale (figure 2e) a révélé que les deux CPMV et CPMV-PEG nanoparticules rapidement étiquetés la vascularisation entier, mais l'absorption de CPMV-PEG par la tumeur était d'environ 3 fois plus élevé que CPMV après 12 heures (figure 3a). La captation tumorale relative de nanoparticules a été déterminé en utilisant le logiciel d'analyse d'image (Volocity de Perkin Elmer). Régions d'intérêt ont été choisis au sein et en dehors de la tumeur (dans le compartiment stromal) et l'intensité moyenne de fluorescence de chacun a été déterminé. Les données sont exprimées en tumeur / stroma ratio.
Figure 1. Microinjection de tumeurs dans la CAM d'un embryon aviaire. (A) L'appareil est assemblé à partir de micro-injection des composants comme indiqué. (B) des embryons aviaire au jour 9 sont prêts à être inoculés avec la tumeur lors de la CAM s'est propagé à couvrir toute la surface. (C) Au jour 16, la tumeur aura atteint jusqu'à 1 cm de diamètre (ligne pointillée) et est prête pour l'injection des nanoparticules.
Figure 2. Injection de nanoparticules et de l'imagerie intravitale. Injection sous un microscope de dissection montrant (a) la pointe de l'aiguille microinjecteur prêt à être injecté dans la veine CAM et (b) l'aiguille microinjecteur inséré dans la veine (indiqué par la flèche) et de nanoparticules injectées dans la circulation sanguine (vu par compensation de sang). (C) l'unité d'imagerie contenant embryon aviaire avec la lamelle interfacé directement avec la CAM. (D) Avant l'injection de nanoparticules, la vascularisation tumorale est évaluée en utilisant l'imagerie intravitale après l'injection de fluorescéine dextrane. (E) l'unité d'imagerie contenant l'embryon placé sur la platine d'un microscope confocal à droite au sein d'une régulation de température mis enceinte à 37 ° C.
Figure 3. Visualisation de l'absorption des nanoparticules intravitale dans les tumeurs humaines. Les tumeurs sont visualisées 7 heures après l'injection de (a) CPMV-AF647 et (b) CPMV-PEG-AF647. d) L'excision de la tumeur de l'embryon aviaire pour une analyse ultérieure.