Cette étude décrit le diagnostic de la grippe aviaire chez les oiseaux sauvages en utilisant un portable RT-PCR système. La méthode tire parti des réactifs lyophilisés à l'écran les oiseaux sauvages dans un cadre non-laboratoire, typique d'un scénario d'épidémie. L'utilisation d'outils moléculaires fournit des solutions de rechange précise et sensible pour le diagnostic rapide.
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Article de méthode
Diagnostic rapide du virus de la grippe aviaire chez les oiseaux sauvages: L'utilisation d'un portable RT-PCR et lyophilisés réactifs dans le domaine
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les oiseaux sauvages ont été impliqués dans la propagation de l'influenza aviaire hautement pathogène (IAHP) de sous-type H5N1, ce qui incite de surveillance le long des voies migratoires. L'échantillonnage des oiseaux sauvages du virus de la grippe aviaire (AIV) est souvent menée dans des régions éloignées, mais les résultats sont souvent retardées en raison de la nécessité de transporter les échantillons à un laboratoire équipé pour des tests moléculaires. En temps réel de la transcriptase inverse de la chaîne par polymérase (RT-PCR) est une technique moléculaire qui offre l'une des méthodes les plus précises et sensibles pour le diagnostic de l'AIV. Les protocoles de laboratoire préalablement strict nécessaire pour la RT-PCR sont maintenant adaptés pour le champ. Développement de réactifs lyophilisés (lyophilisé) qui ne nécessitent pas la chaîne du froid, avec une sensibilité au niveau des réactifs humide a amené les tests sur site distant à un but pratique.
Nous présentons ici une méthode pour le diagnostic rapide de l'AIV chez les oiseaux sauvages en utilisant une unité de RT-PCR (Ruggedized avancée des périphériques d'identification des agents pathogènes ou rapide, des technologies de l'Idaho, de Salt Lake City, UT) qui emploie des réactifs lyophilisés (grippe A Cible 1 Taqman; Asay -ASY-0109, Technologies Idaho). Les réactifs contiennent tous les composants nécessaires pour les tests à des concentrations appropriées dans un seul tube: amorces, des sondes, des enzymes, les tampons et les contrôles internes positifs, éliminant les erreurs liées à un mauvais entreposage ou la manipulation de réactifs humide. L'unité portable effectue un écran pour la grippe A en ciblant le gène de la matrice et donne des résultats en 2-3 heures. Sous-typage génétique est également possible avec un apprêt H5 et H7 jeux qui ciblent le gène hémagglutinine.
Le système est adapté pour une utilisation sur des échantillons cloacaux et oropharyngée prélevés sur des oiseaux sauvages, comme l'a montré ici sur les espèces de limicoles migrateurs, le bécasseau d'Alaska (Calidrus mauri) capturé en Californie du Nord. La manipulation des animaux suivis protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux et de l'utilisation de l'US Geological Survey Western Centre de recherche écologique et permet de l'Oiseau US Geological Survey Banding Laboratory. Le principal avantage de cette technique est d'accélérer le diagnostic des oiseaux sauvages, ce qui augmente les chances de contenir une épidémie dans un endroit éloigné. Diagnostic sur site serait également s'avérer utile pour identifier et étudier les individus infectés dans les populations sauvages. La possibilité de collecter des informations sur la biologie hôte (réponse immunologique et physiologique à l'infection) et de l'écologie spatiale (performance migratoires des oiseaux infectés) fourniront un aperçu de la mesure dans laquelle les oiseaux sauvages peuvent agir comme des vecteurs de l'AIV sur de longues distances.
Protocole
1. Capture d'oiseaux sauvages au moyen de filets brouillard
- Pour la capture d'oiseaux de rivage, mis en place des filets de brume à un site actif butinage, comme un marais, le littoral, ou de la boue à plat.
- Glissez trémails ligne de boucles d'un bout du filet autour du pôle et insérez pole verticalement dans la boue.
- Étends net, insérez le deuxième pôle à travers les boucles trémails à l'autre extrémité du filet de brume et verticalement, insérez poteau dans la boue, en s'assurant que les lignes trémails sont enseignées.
- Une fois qu'un oiseau est capturé, extrait de l'oiseau du filet et revenir à la station de baguage.
2. Cloacaux tige d'échantillonnage
- Recueillir des écouvillons cloacaux immédiatement après sa capture
- Localisez le cloaque et l'utilisation des doigts pour repousser plumes entourant
- Déballer une Dacron ou stériles polyester-tige, tige première extrémité, et humidifier le bout avec les milieux stériles de transport viral pour une plus grande aisance dans pistonnage. Après humidification, toute la tête de l'écouvillon est délicatement inséré dans le cloaque. Nettoyer la circonférence intérieure du cloaque par le virevoltant l'écouvillon lentement et enlever la tige du cloaque.
- Insertion de la pointe de tige directement dans le flacon d'échantillon de transport viral médias; tourner la tige de l'écouvillon entre le pouce et l'index tandis que la tige est dans les médias. Vous avez un assistant de terminer la procédure en tirant le bout de l'arrière-tige au fond de la fiole ~ 1 cm et couper la tige de la tige avec une paire de ciseaux pour la pointe tige reste dans le flacon et l'arbre ne pas interférer avec bouchon de fermeture. Flacon bouchon. Désinfecter les ciseaux avec de l'alcool dans les arbres de coupe entre le coton-tige.
- Placer les flacons dans une boîte de congélation contenant soit de la glace sèche ou de la glace.
3. Oropharyngée prélèvement tige
- Ouvrez doucement le bec de l'oiseau de sorte que la fente est visible choanes
- Déballer un écouvillon propre à partir de l'emballage, la tige première extrémité, et humidifier le bout avec les médias de transport viral pour une plus grande aisance dans écouvillonnage
- Sans toucher la pointe d'autres surfaces, l'insérer dans la bouche et nettoyer l'ouverture des choanes sur le toit de la bouche et continuer en direction de la région oropharyngée ou de la gorge
- Placez l'extrémité tige directement dans le transport des médias flacon virale. Tournez la tige de l'écouvillon entre le pouce et l'index tandis que la tige est dans les médias. Comme ci-dessus, un assistant tirez la pointe de l'arrière-tige au fond de la fiole ~ 1 cm et couper la tige de la tige avec une paire de ciseaux pour la pointe tige reste dans le flacon et l'arbre n'interfère pas avec le chapeau fermeture. Flacon bouchon. Désinfecter les ciseaux avec de l'alcool dans les arbres de coupe entre le coton-tige.
- Placer les flacons dans une boîte de congélation contenant de la glace sèche ou de la glace.
4. La manipulation d'oiseaux et la libération
- Retour des oiseaux sur le site de capture et de libération dans les meilleurs délais (<20min). Gestionnaires doivent être conscients des principes de protection des animaux et être attentifs aux signes de la souffrance des oiseaux lors de l'échantillonnage (c.-à-abrasions, la capture et la myopathie hypo-ou hyperthermie). Une trousse de premiers soins devraient être inclus dans la liste des équipements.
5. Installations d'essai
- Les échantillons peuvent être testés dans un espace confiné comme une remorque de recherche ou d'une tente, avec une alimentation électrique (générateur de tension régulée) pour faire fonctionner l'appareil PCR et l'ordinateur relié.
6. Extraction de l'ARN
- L'extraction d'ARN a été réalisée avec le kit RNeasy Mini avec des modifications mineures aux instructions du fabricant suivantes Spackman et al. 1
- Vortex, le support écouvillon pour 3-5 s et de transfert 350 pi à un microtube de 2 ml. Remarque: Conservez l'échantillon restant sur la glace en cas de PCR positive des échantillons doivent être recriblés H5 ou test doit être exécuté.
- Ajouter 350 pi de tampon RLT (avec β-moi) et vortex pendant 5 s.
- Ajouter 350 ul d'ARN 70% d'éthanol de grade.
- Centrifuger à 5000 xg pendant 5 min.
- Ajouter 600 ul du surnageant dans une colonne spin placé dans un tube collecteur de 2 ml. Conserver l'échantillon restant dans le portoir.
- Centrifuger pendant 20 s à 10 000 xg et jetez accréditives.
- Répétez les étapes 17 à 18 jusqu'à ce que tous l'échantillon a été passé à travers la colonne.
- Placer la colonne spin dans un tube collecteur de 2 ml.
- Ajouter 700 ul de tampon RW1 à la colonne et centrifuger 25 s à 10 000 x g. Jeter l'effluent à travers.
- Ajouter 500 ul de tampon RPE à la colonne et centrifuger pendant 25 s à 10 000 x g. Jeter l'effluent à travers.
- Répétez l'étape 22 pour un total de deux lavages avec le tampon RPE.
- Centrifuger la colonne de spin pour un supplément de 2 minutes à 14000 x g. Jeter le tube collecteur.
- Placer la colonne spin dans un endroit propre microtube 1,5 ml et ajouter 50 pl d'eau sans nucléase. Incuber à température ambiante pendant 60 s.
- Eluer ARN en faisant tourner pendant 60 s à 10 000 xGFou 60 s. Placer l'échantillon sur la glace purifiée.
7. Préparation des contrôles négatifs
- Réactifs lyophilisés ont été préparés pour utilisation dans le dosage par PCR selon les instructions de l'Idaho Technologies lyophilisées kit de détection Réactif pour TaqMan Sondes grippe A Objectif 1 (Asay-ASY-0109).
- Centrifugeuse négative flacon de réactif de contrôle (rouge) pendant 3 s pour assurer granulés sont à la base.
- Enlever le capuchon, visuellement faire des boulettes que sont à la base.
- Ajouter 20 ul de tampon de reconstitution 2 X et 20 ul d'eau de qualité réactive.
- Récapitulation et vortex pendant 5 s à vitesse maximale.
- Centrifuger pendant 3 s pour apporter de liquide au fond du flacon.
- Vérifier visuellement le culot a réhydraté, si ce n'est répéter les étapes 31-32.
- Pipeter 19 ul du mélange hydraté dans un tube capillaire Lightcycler, répétez l'étape pipette dans un tube capillaire secondes pour obtenir un duplicata.
8. Échantillons Préparation
- Centrifugeuse flacon de réactif inconnu (bleu) pendant 3 secondes afin d'assurer les granulés sont à la base.
- Enlever le capuchon, visuellement faire des boulettes que sont à la base.
- Ajouter 40 ul d'ARN purifié.
- Récapitulation et vortex pendant 5 s à vitesse maximale.
- Centrifuger pendant 3 s pour apporter de liquide au fond du flacon.
- Vérifier visuellement le culot a réhydraté, si ce n'est répéter les étapes 38-39.
- Pipeter 19 ul de mélange hydraté dans un tube capillaire Lightcycler, répétez l'étape pipette dans un tube capillaire secondes pour obtenir un duplicata.
9. Préparation des contrôles positifs
- Centrifuger le flacon de contrôle positif réactif (vert) pendant 3 s pour assurer les granulés sont à la base.
- Enlever le capuchon, visuellement faire des boulettes que sont à la base.
- Ajouter 20 ul de tampon de reconstitution 2 X et 20 ul d'eau de qualité réactive.
- Récapitulation et vortex pendant 5 s à vitesse maximale.
- Centrifuger pendant 3 s pour apporter de liquide au fond du flacon.
- Vérifier visuellement le culot a réhydraté, si ce n'est répéter les étapes 45-46.
- Pipeter 19 ul du mélange hydraté dans un tube capillaire Lightcycler, répétez l'étape pipette dans un tube capillaire secondes pour obtenir un duplicata.
10. La centrifugation des tubes capillaires
- Une fois que tous les tubes capillaires pour le lot ont été préparés les charger dans le mini-centrifugeuse équipée d'adaptateurs capillaire.
- Centrifuger à réglage le plus bas en maintenant le bouton d'impulsion vers le bas pour 1 s. Ce transfert de liquide vers le bas en préparation pour les tests.
11. Fonctionnement du RAPID
- Créez un nouveau fichier. Contrôle Label positif, témoin négatif, et des échantillons (par leur numéro d'identification).
- Programme 1: Préparation des échantillons d'ARN Tenir
- Cycles = 1
- Mode d'analyse = Aucun
- Température cible = 40
- = Temps d'incubation 30 min
- Taux de transition de température = 20 ° C / s (par défaut)
- Température cible secondaire = 0 (par défaut)
- Taille étape = 0 (par défaut)
- Retard étape = 0 (par défaut)
- Mode d'acquisition = Aucun (par défaut)
- Programme 2: ARN Dénaturation
- Cycles = 1
- Mode d'analyse = Aucun
- Température cible = 94
- = Temps d'incubation 120s
- Taux de transition de température = 20 ° C / s (par défaut)
- Température cible secondaire = 0 (par défaut)
- Taille étape = 0 (par défaut)
- Retard étape = 0 (par défaut)
- Mode d'acquisition = Aucun (par défaut)
- Programme 3: amplification de l'ARN
- Cycles = 45
- Mode d'analyse Analyse automatique =
- Température cible, le segment 1 = 94; Segment 2 = 60
- Temps d'incubation, Segment 1 = 0 s, Segment 2 = 20 s
- Taux de transition de température, Seg 1 & 2 = 20 ° C / s (par défaut)
- Température cible secondaire, Seg 1 & 2 = 0 (par défaut)
- Taille étape, Seg 1 & 2 = 0 (par défaut)
- Retard étape, Seg 1 & 2 = 0 (par défaut)
- Mode d'acquisition, le segment 1 = Aucun; Segment 2 = simple
- Paramètres de fluorescence
- Mode d'affichage: le canal de fluorescence 2 (Ch2 / 1)
Les gains:- Ch. 1 (F1) = 1
- Ch. 2 (F2) = 8
- Ch. 3 (F3) = 1
- Pour afficher les données en temps réel par fluorescence pour chaque échantillon, sélectionner l'échantillon d'intérêt et de cliquer sur le bouton «Afficher le graphique» au bas de l'écran
- Mode d'affichage: le canal de fluorescence 2 (Ch2 / 1)
- Pour chaque capillaire, les résultats sont les suivants:
- # - Identifie la position du carrousel carrousel
- Nom de l'échantillon - fournit le nom de l'échantillon
- Contrôle - identifie également le type d'échantillon pour chaque échantillon
- Score - calculée en utilisant la relation entre la fluorescence de l'échantillon et le niveau de fluorescence de fond dans l'échantillon
- Résultat - affiche le résultat global de l'échantillon
12. Les résultats représentatifs:
Présent: Un rouge «présent» appel à un test / échantillon inconnu indique que la cible a été identifié dans l'échantillon et les contrôles ont été réussies.Non détecté: «non détecté» Un vert appel à un test / échantillon inconnu indique que la cible n'a pas été identifié dans l'échantillon et les contrôles d'essai ont été réussies.
S'il vous plaît répéter: Un «s'il vous plaît répétez 'indique que le contrôle positif ou négatif échoué.
Un exemple d'une analyse réussie par le 7200 RAPID est montré dans la figure 4. Le contrôle positif est amplifié et génère fluorescence détectable (axe Y) à environ 25 cycles (axe x). Un cycle seuil (CT)> 35 est le seuil accepté pour la plupart des laboratoires de référence VIA. Par conséquent, les contrôles positifs à cette méthode produit un signal fluorescent dans le nombre de cycles acceptée (0-35) pour la détection de l'AIV. En revanche, le contrôle négatif ne génère pas un signal fluorescent, même après 45 cycles. De même, les douze échantillons prélevés dans les bécasseaux l'Ouest n'ont pas de générer un signal fluorescent indiquant que les oiseaux ont été négatifs pour l'AIV. Des tests de suivi de tous les échantillons positifs dans un laboratoire traditionnel est encouragé à veiller à ce qu'aucun faux positifs sont produites par erreur.
Figure 1. Capture d'oiseaux de rivage en utilisant filets.
Figure 2. Collecte d'échantillons cloacaux et de l'oropharynx de moins bécasseaux.
Figure 3. Programmation du 7200 RAPIDE pour l'amplification de l'ARN.
Figure 4. Fluorogram générés par le RAPID 7200 portables rRT-PCR montrant comment les contrôles positifs et négatifs devraient apparaître dans un essai réussi. Cliquez ici pour voir l'image pleine grandeur
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Discussion
La méthode de diagnostic rapide facilite les tests présentés ici de temps précis et efficace des échantillons d'oiseaux sauvages pour la surveillance de l'AIV. Les exigences beaucoup moins strictes de stockage portables spécimen de RT-PCR sont adaptés à des situations isolées où le maintien d'une chaîne du froid peut être impraticable si les expéditeurs azote liquide ou de glace sèche n'est pas disponible. De plus, nous avons constaté que l'analyse de l'échantillon avec les réactifs lyophilisés a...
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Nous tenons à remercier M. Scullion et R. Crisp des Technologies de l'Idaho pour le soutien technique et le Centre de recherche écologique USGS occidentaux pour le financement (S. Schwarzbach) et l'assistance (K. Spragens, T. Graham). Cette recherche a été réalisée sous les auspices du Centre pour la technologie innovatrice - Institut pour la Défense et la Sécurité intérieure (www.idhs.org), à l'appui du ministère de la Défense et Air Force Research Laboratory. La manipulation des animaux suivis protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux et de l'utilisation de l'US Geological Survey Western Centre de recherche écologique et permet de l'Oiseau US Geological Survey Banding Laboratory. Toute utilisation des appellations commerciales, des produits, ou de l'entreprise dans cette publication est à des fins descriptives et n'implique pas l'approbation par le gouvernement américain.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Société | Numéro de catalogue | Commentaires (optionnel) |
| RNeasy mini colonne de centrifugation | Qiagen | 74106 | Inclus dans kit RNeasy Mini |
| Tubes de prélèvement (1,5 et 2 ml) | Qiagen | 74106 | Inclus dans kit RNeasy Mini |
| Tampon RLT | Qiagen | 74106 | Inclus dans kit RNeasy Mini |
| Tampon RW1 | Qiagen | 74106 | Inclus dans kit RNeasy Mini |
| Le tampon RPE | Qiagen | 74106 | Inclus dans kit RNeasy Mini |
| L'eau sans RNase | Qiagen | 74106 | Inclus dans kit RNeasy Mini |
| 14,3 M β-mercaptoéthanol solution | Fisher Scientific | BP176100 | |
| 100% d'éthanol | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2, 120V | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Taqman grippe A Objectif 1 (sonde d'hydrolyse) | Technologies Idaho | Asay-ASY-0109 | |
| Lightcycler 20ml tubes capillaires | Roche Applied Science | 04929292001 | |
| Micro-centrifugeuse avec rotateur pour tubes de 2 ml | Technologies Idaho | Inclus dans le kit RAPIDE | |
| Renforcé avancée des périphériques d'identification des agents pathogènes (RAPID) 7200 | Technologies Idaho | Inclus dans le kit RAPIDE | |
| Pentium ordinateur portable avec Windows XP Professionnel | Technologies Idaho | Inclus dans le kit RAPIDE | |
| Analyse des données du logiciel LightCycler | Technologies Idaho | Inclus dans le kit RAPIDE |
Références
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Takekawa, J. Y. Field detection of avian influenza virus in wild birds: evaluation of a portable rRT-PCR system and freeze-dried reagents. J Virol Methods. 166, 92-97 (2010).
- Das, A., Spackman, E., Senne, D., Pedersen, J., Suarez, D. L. Development of an internal positive control for rapid diagnosis of avian influenza virus infections by real-time reverse transcription-PCR with lyophilized reagents. J Clin Microbiol. 44, 3065-3073 (2006).
- Spackman, E., Suarez, D. L. Avian influenza virus RNA extraction from tissue and swab material. Methods Mol Biol. 436, 13-18 (2008).
- Chen, R., Holmes, E. C. Frequent inter-species transmission and geographic subdivision in avian influenza viruses from wild birds. Virology. , 383-3156 (2009).
- Macken, C. A., Webby, R. J., Bruno, W. J. Genotype turnover by reassortment of replication complex genes from avian influenza A virus. J Gen Virol. 87, 2803-2815 (2006).
- Dugan, V. G. The evolutionary genetics and emergence of avian influenza viruses in wild birds. PLoS Pathog.. 4, e1000076-e1000076 (2008).
- Spackman, E. Phylogenetic analyses of type A influenza genes in natural reservoir species in North America reveals genetic variation. Virus Res. 114, 89-100 (2005).
- Pasick, J. Advances in the molecular based techniques for the diagnosis and characterization of avian influenza virus infections. Transbound Emerg Dis. 55, 329-338 (2008).
- OIE Manual of diagnostics tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and bees). 1, 258-269 (2004).
- Weber, T. P., Stilianakis, N. I. Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds. Emerg. Infect. Dis. 13, 1139-1143 (2007).
- Kim, J. -K., Negovetich, N. J., Forrest, H. L., Webster, R. G. Ducks: the "Trojan Horses" of H5N1 influenza. Influenza and Other Respiratory Viruses. , 121-128 (2009).
- Gilbert, M. Flying over an infected landscape: distribution of highly pathogenic avian influenza H5N1 risk in South Asia and satellite tracking of wild waterfowl. Ecohealth. , (2010).
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Réimpressions et autorisations
