Cette étude décrit le diagnostic de la grippe aviaire chez les oiseaux sauvages en utilisant un portable RT-PCR système. La méthode tire parti des réactifs lyophilisés à l'écran les oiseaux sauvages dans un cadre non-laboratoire, typique d'un scénario d'épidémie. L'utilisation d'outils moléculaires fournit des solutions de rechange précise et sensible pour le diagnostic rapide.
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Article de méthode
Diagnostic rapide du virus de la grippe aviaire chez les oiseaux sauvages: L'utilisation d'un portable RT-PCR et lyophilisés réactifs dans le domaine
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les oiseaux sauvages ont été impliqués dans la propagation de l'influenza aviaire hautement pathogène (IAHP) de sous-type H5N1, ce qui incite de surveillance le long des voies migratoires. L'échantillonnage des oiseaux sauvages du virus de la grippe aviaire (AIV) est souvent menée dans des régions éloignées, mais les résultats sont souvent retardées en raison de la nécessité de transporter les échantillons à un laboratoire équipé pour des tests moléculaires. En temps réel de la transcriptase inverse de la chaîne par polymérase (RT-PCR) est une technique moléculaire qui offre l'une des méthodes les plus précises et sensibles pour le diagnostic de l'AIV. Les protocoles de laboratoire préalablement strict nécessaire pour la RT-PCR sont maintenant adaptés pour le champ. Développement de réactifs lyophilisés (lyophilisé) qui ne nécessitent pas la chaîne du froid, avec une sensibilité au niveau des réactifs humide a amené les tests sur site distant à un but pratique.
Nous présentons ici une méthode pour le diagnostic rapide de l'AIV chez les oiseaux sauvages en utilisant une unité de RT-PCR (Ruggedized avancée des périphériques d'identification des agents pathogènes ou rapide, des technologies de l'Idaho, de Salt Lake City, UT) qui emploie des réactifs lyophilisés (grippe A Cible 1 Taqman; Asay -ASY-0109, Technologies Idaho). Les réactifs contiennent tous les composants nécessaires pour les tests à des concentrations appropriées dans un seul tube: amorces, des sondes, des enzymes, les tampons et les contrôles internes positifs, éliminant les erreurs liées à un mauvais entreposage ou la manipulation de réactifs humide. L'unité portable effectue un écran pour la grippe A en ciblant le gène de la matrice et donne des résultats en 2-3 heures. Sous-typage génétique est également possible avec un apprêt H5 et H7 jeux qui ciblent le gène hémagglutinine.
Le système est adapté pour une utilisation sur des échantillons cloacaux et oropharyngée prélevés sur des oiseaux sauvages, comme l'a montré ici sur les espèces de limicoles migrateurs, le bécasseau d'Alaska (Calidrus mauri) capturé en Californie du Nord. La manipulation des animaux suivis protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux et de l'utilisation de l'US Geological Survey Western Centre de recherche écologique et permet de l'Oiseau US Geological Survey Banding Laboratory. Le principal avantage de cette technique est d'accélérer le diagnostic des oiseaux sauvages, ce qui augmente les chances de contenir une épidémie dans un endroit éloigné. Diagnostic sur site serait également s'avérer utile pour identifier et étudier les individus infectés dans les populations sauvages. La possibilité de collecter des informations sur la biologie hôte (réponse immunologique et physiologique à l'infection) et de l'écologie spatiale (performance migratoires des oiseaux infectés) fourniront un aperçu de la mesure dans laquelle les oiseaux sauvages peuvent agir comme des vecteurs de l'AIV sur de longues distances.
Protocole
1. Capture d'oiseaux sauvages au moyen de filets brouillard
- Pour la capture d'oiseaux de rivage, mis en place des filets de brume à un site actif butinage, comme un marais, le littoral, ou de la boue à plat.
- Glissez trémails ligne de boucles d'un bout du filet autour du pôle et insérez pole verticalement dans la boue.
- Étends net, insérez le deuxième pôle à travers les boucles trémails à l'autre extrémité du filet de brume et verticalement, insérez poteau dans la boue, en s'assurant que les lignes trémails sont enseignées.
- Une fois qu'un oiseau est capturé, extrait de l'oiseau du filet et revenir à la station de baguage. <....
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Discussion
La méthode de diagnostic rapide facilite les tests présentés ici de temps précis et efficace des échantillons d'oiseaux sauvages pour la surveillance de l'AIV. Les exigences beaucoup moins strictes de stockage portables spécimen de RT-PCR sont adaptés à des situations isolées où le maintien d'une chaîne du froid peut être impraticable si les expéditeurs azote liquide ou de glace sèche n'est pas disponible. De plus, nous avons constaté que l'analyse de l'échantillon avec les réactifs lyophilisés a.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Nous tenons à remercier M. Scullion et R. Crisp des Technologies de l'Idaho pour le soutien technique et le Centre de recherche écologique USGS occidentaux pour le financement (S. Schwarzbach) et l'assistance (K. Spragens, T. Graham). Cette recherche a été réalisée sous les auspices du Centre pour la technologie innovatrice - Institut pour la Défense et la Sécurité intérieure (www.idhs.org), à l'appui du ministère de la Défense et Air Force Research Laboratory. La manipulation des animaux suivis protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux et de l'utilisation de l'US Geological Survey Western Centre de recherche écologique et perme....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Société | Numéro de catalogue | Commentaires (optionnel) |
| RNeasy mini colonne de centrifugation | Qiagen | 74106 | Inclus dans kit RNeasy Mini |
| Tubes de prélèvement (1,5 et 2 ml) | Qiagen | 74106 | Inclus dans kit RNeasy Mini |
| Tampon RLT | Qiagen | 74106 | Inclus dans kit RNeasy Mini |
| Tampon RW1 | Qiagen | 74106 | Inclus dans kit RNeasy Mini |
| Le tampon RPE | Qiagen | 74106 | Inclus dans kit RNeasy Mini |
| L'eau sans RNase | Qiagen | 74106 | Inclus dans kit RNeasy Mini |
| 14,3 M β-mercaptoéthanol solution | Fisher Scientific | BP176100 | |
| 100% d'éthanol | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2, 120V | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Taqman grippe A Objectif 1 (sonde d'hydrolyse) | Technologies Idaho | Asay-ASY-0109 | |
| Lightcycler 20ml tubes capillaires | Roche Applied Science | 04929292001 | |
| Micro-centrifugeuse avec rotateur pour tubes de 2 ml | Technologies Idaho | Inclus dans le kit RAPIDE | |
| Renforcé avancée des périphériques d'identification des agents pathogènes (RAPID) 7200 | Technologies Idaho | Inclus dans le kit RAPIDE | |
| Pentium ordinateur portable avec Windows XP Professionnel | Technologies Idaho | Inclus dans le kit RAPIDE | |
| Analyse des données du logiciel LightCycler | Technologies Idaho | Inclus dans le kit RAPIDE |
Références
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Takekawa, J. Y.
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Réimpressions et autorisations
