Une des caractéristiques pathologiques de la MA est la formation de plaques amyloïdes β protéines neuritique positif. Dans ce protocole, nous décrivons deux méthodes pour détecter les plaques séniles dans le modèle de souris transgéniques AD: détection immunohistochimique utilisant la méthode ABC et DAB et détection par fluorescence en utilisant la méthode de coloration thioflavine S.
Article de méthode
La détection de plaques séniles dans le modèle d'Alzheimer La maladie de la souris
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Dans cet article
Résumé
Résumé
La maladie d'Alzheimer (MA) est le trouble neurodégénérative la plus fréquente conduisant à la démence. Formation de plaques séniles est l'une des caractéristiques pathologiques de la maladie d'Alzheimer. Le composant central de plaques séniles est une petite protéine appelée protéine filamenteuse β-amyloïde (Aß) 1, qui est dérivé du clivage protéolytique séquentiel de la protéine précurseur bêta-amyloïde (APP) par β-sécrétase et γ-sécrétase. L'hypothèse amyloïde implique que Aγ contenant des plaques que le mécanisme sous-jacent dans la pathologie de la MA toxiques 2. L'analyse post-mortem de la présence de plaques séniles confirme le diagnostic de la MA. Pour approfondir notre compréhension de la neurobiologie Aγ dans la pathogenèse de AD, différentes souches de souris exprimant AD liés à des mutations dans les gènes APP humaine ont été générés. Selon la gravité de la maladie, ces souris se développera plaques séniles à des âges différents. Ces souris sont des outils précieux pour étudier le développement pathogenèse et de médicaments qui pourraient affecter la voie de traitement APP et la formation des plaques séniles. Dans ce protocole, nous employons une méthode immunohistochimique pour la détection spécifique de plaques séniles chez la souris modèle AD. Nous allons discuter spécifiquement de la préparation d'extraire le cerveau et demi, la fixation de paraformaldéhyde, cryosectioning, et deux méthodes pour détecter les plaques névrotique chez des souris transgéniques AD: détection immunohistochimique utilisant la méthode ABC et DAB et détection par fluorescence en utilisant la méthode de coloration thiofalvin S.
Protocole
1. Fixation des cerveaux de souris et de cryosectioning
- Les souris transgéniques sont sacrifiés à l'aide de gaz de dioxyde de carbone, suivie par la décapitation et le cerveau extrait.
- Le cerveau est disséqué longitudinalement au centre. La moitié du cerveau seront surgelés sur glace sèche pour l'analyse biochimique. L'autre sera submergé dans du paraformaldéhyde 4% (PFA) pour au moins 48 heures à 4 ° C.
- Après fixation au PFA 4% pendant au moins 48 heures, le cerveau hémi est transféré directement dans la solution de saccharose à 30% et placés à 4 ° C. Au point, le cerveau hémi doit être flottant dans la solution de saccharose. Quand le cerveau hémi coulé au fond, nécessitant habituellement environ 48 heures, il est prêt à être incorporé dans PTOM pour cryosectioning.
- Avant cryosectioning, monter une fine couche de PTOM sur le bouton et laisser congeler à -20 ° C. Retirez le cervelet du reste du cerveau hémi et placer sur la couche de gelée octobre Recouvrir immédiatement le cerveau avec des hémi PTOM et permettent une lente congeler à -20 ° C. Une fois l'enrobage PTOM Le cerveau a tourné opaque, il est prêt à être sectionné.
- Définissez l'épaisseur de chaque section à 30 um. Recueillir chaque tranche dans un récipient avec D'Olomos solution.
2. Procédure d'immunohistochimie pour plaques séniles (gratuit sections flottantes)
- Traiter chaque section dans l'acide formique à 88% pendant 15 minutes. Après traitement à l'acide formique, la section sera temporairement tournera opaque et peut apparaître à se ratatiner.
- Retirez chaque section dans une plaque et laver avec Tx-PBS (0,3% de Triton X-100 dans du PBS) pendant 5 min x 3 avec agitation douce.
- Peroxyde bloc endogène bloquant 0,5% H 2 O 2 en Tx-PBS, RT 30 min en remuant doucement.
- Lavez section avec Tx-PBS pendant 10 min x 3 avec agitation douce.
- La section de bloc avec 5% non gras du lait écrémé dissous dans Tx-PBS à température ambiante pendant 1 heure en agitant doucement.
- Incuber sections dans l'anticorps primaire (biotinylé 4G8, 1:500-1:2000, Sceau) dilué dans Tx-PBS contenant 5% de lait à 4 ° C pendant une nuit sous agitation douce.
- Lavez section avec Tx-PBS pendant 10 min x 3 avec agitation douce.
- Préparer le protocole du fabricant ABC solution suivante (Elite ABC, Vector Laboratories,). Incuber sections dans le mélange de ABC pendant 30 min en remuant doucement.
- Lavez section avec Tx-PBS pendant 10 min x 3 avec agitation douce.
- Préparer 3,3 '-diaminobenzidine tétrachlorhydrate (DAB) (Vector Laboratories) le protocole du fabricant. Incuber le mélange de sections DAB pendant 5-10 min. À ce stade, vous pourrez observer une couleur brunâtre se développer sur chaque section.
- Lavez section avec Tx-PBS pendant 10 min x 3 avec agitation douce.
- Coupes de cerveau flottant sont montées sur des lames recouvertes de gélatine, pour aider à l'adhérence des tissus. Les articles sont ensuite séchés à l'air suivie par compensation avec une série de xylène et monté dans Entellen.
- Les plaques sont visualisés en microscopie optique à un grossissement de 40X et sont quantifiés en évaluant le nombre de plaques signifie par tranche pour chaque souris.
3. Thioflavine S coloration procédure de détection de plaques séniles
- Le sacrifice de la souris et la procédure d'extraction du cerveau sont, comme indiqué dans les sections 1.1 à 1.5.
- Mont 4 à 5 coupes de cerveau hémi sur une lame de verre et laisser sécher à l'air complètement avant la coloration.
- Laver les lames à l'éthanol 70% pendant 1 minute.
- Laver les lames avec de l'éthanol 80% pendant 1 minute.
- Incuber les lames dans la solution filtrée (filtre de 0,2 um) thioflavine S (1% dans 80% d'éthanol) pendant 15 minutes. (Solution thioflavine S doit être filtrée avant chaque utilisation). Remarque: protéger la thioflavine S de la lumière et à protéger les lames colorées de la lumière.
- Laver les lames avec de l'éthanol 80% pendant 1 minute.
- Laver les lames avec de l'éthanol 1 minute à 70%.
- Laver à l'eau distillée deux fois.
- Mont diapositives en milieu aqueux de montage et permettent lames sécher dans l'obscurité pendant au moins 2 heures, suivie par la lamelle d'étanchéité avec du vernis à ongles transparent. Les sections colorées doivent être stockés dans l'obscurité à 4 ° C.
- La fluorescence verte plaques colorées pourrait être visualisées avec microscropy fluorescentes. Analyser des diapositives dans une semaine à cause de la coloration va s'estomper avec le temps.
4. Les résultats représentatifs
Dans notre étude récente sur l'efficacité du médicament anti-épileptique et l'acide stabilisateur de l'humeur valproïque (VPA) à inhiber la formation de plaques séniles, nous avons utilisé l'immunomarquage ci-dessus décrites et thioflavine S coloration des procédures pour identifier les plaques séniles chez la souris modèle AD (3). La figure 1 représente une caractéristique de 9 mois APP23 souris transgénique, teinté d'anti-Aß utilisant 4G8 biotinylé et détectée par la méthode ABC. Plaques séniles sont clairement marquées avec l'anticorps et sont indiqués par des flèches blanches. Utilisant une coloration thioflavine S, nous avons détecté dépôt de plaque neuritique 2 mois APP23xPS TRAnsgenic souris (figure 2). Thioflavine S liée plaques séniles contenant Aßi apparaît sous microscopie à fluorescence verte (indiquées par des flèches blanches). Nous avons montré que le traitement APV, la formation de plaques séniles est significativement réduite (3). Dans une autre étude, nous avons étudié l'hypoxie lien moléculaire sous-jacente et la pathogenèse AD. Encore une fois, en utilisant à la fois coloration immunohistochimique 4G8 anti-Aß et coloration thioflavine S, nous avons constaté que l'hypoxie a facilité la formation de plaques séniles contenant Aß (4).
Figure 1. L'analyse immunohistochimique de formation de plaques séniles chez des souris transgéniques après JC. APP23 souris à l'âge de 9 mois ont été sacrifiés et ont été disséqués, fixe, et sectionné. Plaques séniles dans le hippocampe ont été détectés en utilisant un anticorps anti-4G8 Aßi et ont été développés en utilisant les méthodes ABC et DAB. Les plaques ont été visualisées par microscopie optique en 40X. Les flèches blanches au point de plaques séniles Aß.
Figure 2. Coloration thioflavine S de plaques séniles chez les souris AD modélisés. APP23xPS45 souris doublement transgéniques à 8 semaines ont été sacrifiés et ont été disséqués, fixe, et sectionné. Fléaux neuritique dans l'hippocampe sont ont été confirmés en utilisant coloration fluorescente thioflavine S et visualisées par microscopie à un grossissement de 40X. Les flèches blanches indiquent les plaques séniles thioflavine S tachés.
Discussion
L'immunohistochimie utilisant l'anticorps biotinylé étiquetés taches 4G8 plaques séniles dans la MA modélisé souris avec une spécificité. Le résultat coloration permet la quantification et la comparaison de la charge de la plaque entre les différents groupes de traitement. Il ya plusieurs étapes cruciales qui pourraient affecter le résultat. Parce que les cerveaux ne sont pas hémi perfusé avant l'extraction du crâne, les soins devraient être utilisés pendant le processus d'extraction afin de prévenir les dommages au cerveau hémi. Par ailleurs, puisque le cerveau est passivement hémi perfusé, nous vous recommandons d'incubation de 4% PFA pour au moins 48 heures à 4 ° C avant de plonger dans la solution de saccharose à 30%. Alternativement, la perfusion transcardial pourrait être fait avant l'extraction du cerveau. Si le cerveau est fixé correctement, il doit avoir une texture caoutchouteuse. Dans le cas où le cerveau n'est pas fixée correctement, les sections se déchirer dans la solution D'Olomos ou pendant les procédures de coloration.
L'anticorps monoclonal 4G8 est réactif aux résidus d'acides aminés 17-24 de Aß et reconnu l'épitope dans la séquence de base (VFFAE). Depuis 4G8 proviennent d'espèces de souris, elle tend à donner une coloration de fond plus élevé. Ainsi, nous avons choisi d'incuber les sections à la dilution indiquée par des considérations de parvenir à un vrai signal, tout en minimisant la coloration de fond.
En plus d'immunomarquage pour la détection des plaques séniles en utilisant l'anticorps 4G8, une méthode de coloration thioflavine S est aussi utilisé pour identifier les plaques. Thioflavine S est un mélange de colorant homogène qui résulte de la méthylation de déhydrothiotoluidine avec de l'acide sulfonique. Thioflavine S non sélective lie le contenu des feuillets bêta de protéines, comme celles en oligomères amyloïdes. Lors de la liaison, thioflavine subit un décalage bleue caractéristique de son spectre d'émission. Inversement contraignante thioflavine S pour les formes monomériques ne sera pas susciter un décalage vers le bleu et ne pouvaient pas être détectés avec microscope à fluorescence. Coloration thioflavine S offre une alternative rapide à l'écran de l'amyloïde comme l'intensité de fluorescence permet une bonne visualisation de petites quantités de dépôts amyloïdes. Cependant, un inconvénient de coloration thioflavine S est le manque de spécificité. Beaucoup de composants d'autres tissus, y compris contenant des feuillets bêta étendue, comme fibrinoids, hyalines, la kératine, etc, ont une affinité plutôt pour ce colorant.
Déclarations de divulgation
Toutes les expériences ont été menées en conformité avec l'Université de la Colombie Soins des animaux-Britannique et le comité de l'utilisation et les lignes directrices des IRSC.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par les Instituts canadiens de recherche en santé du Canada (IRSC), la famille Townsend, et Jack Brown et la famille d'Alzheimer Research Foundation (WAS). WS est le titulaire de la Chaire de recherche du Canada sur la maladie d'Alzheimer. PTTL est soutenu par les sciences naturelles et en conseil de recherche en génie et la Fondation Michael Smith pour des bourses de recherche en santé.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif et de l'équipement | Société | Numéro de catalogue | |
| Paraformaldéhyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidene | Sigma-Aldrich | PVP40-100G | |
| Saccharose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| L'éthylène glycol | Sigma-Aldrich | 324 558-2L | |
| Tissue-Tek octobre Compound | Sakura | 4583 | |
| 88% d'acide formique | Fisher Scientific | A118P-500 | |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | 807426 | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 | |
| Biotine 4G8 Anticorps | Cedarlane | SIG-39240-500 | |
| Elite ABC kit | Vecteur | PK-6100 | |
| Imm PACT DAB | Vecteur | SK-4105 | |
| Xylène | Fisher Scientific | X4-4 | |
| Entellan | EM Science | 65037-71 | |
| * Superfrost Plus Lames de microscope | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cryostat | Leica | CM-3050-S | |
| MX35 Premier microtome lame | Thermo Scientific | 3052835 | |
| Thioflavine S | Sigma-Aldrich | T1892-25G |
Références
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120, 885-890 (1984).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H., Zhou, W., Wang, K., Song, W. Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer's disease mouse models. J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).
- Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 18727-18732 (2006).
Réimpressions et autorisations
