Bactérioplancton environnement sont incubés avec un modèle de carbone organique dissous (DOC) composé et un réactif de marquage de l'ADN, bromodésoxyuridine (BrdU). Ensuite, DOC-dégradants cellules sont séparées de la communauté en vrac en fonction de leur incorporation de BrdU élevée en utilisant la fluorescence tri cellulaire (FACS). Ces cellules sont ensuite identifiés par des analyses moléculaires ultérieures.
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Article de méthode
Bromodésoxyuridine (BrdU) l'étiquetage et ultérieures de tri cellulaire activé par fluorescence de la culture indépendante Identification de carbone organique dissous dégradants bactérioplancton
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les microbes sont les principaux agents de médiation de la dégradation de nombreuses carbone organique dissous (DOC) des substrats dans les milieux aquatiques. Toutefois, l'identification des taxons bactériens qui transforment les piscines spécifiques de COD dans la nature pose un défi technique.
Nous décrivons ici une approche qui couple bromodésoxyuridine (BrdU) l'incorporation, tri cellulaire par fluorescence (FACS), et ARNr 16S basée sur l'analyse moléculaire qui permet l'identification indépendante de la culture du bactérioplancton capables de dégrader un composé DOC spécifiques dans les milieux aquatiques. Microcosmes bactérioplancton en triple sont mis en place pour recevoir les deux BrdU et un composé modèle de DOC (DOC amendements), ou seulement BrdU (sans ajout de contrôle). Substituts BrdU les positions de la thymidine dans l'ADN bactérien nouvellement synthétisé et BrdU marqué l'ADN peut être facilement immunodétectée 1,2. Grâce à une incubation de 24 h, bactérioplancton qui sont capables d'utiliser le composé ajouté DOC devraient être activés sélectivement, et ont donc des niveaux plus élevés d'incorporation de BrdU (cellules HI) que les non-réactive les cellules dans les modifications du DOC et les cellules dans un no- Outre les contrôles (faible incorporation de BrdU cellules, les cellules LI). Après immunodétection de fluorescence, les cellules HI sont distingués et physiquement séparé des cellules LI par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) 3. Tri DOC-réactive (cellules HI) sont extraits de l'ADN et taxinomique identifiés par 16S ARNr ultérieure basée sur des analyses, y compris la PCR, la construction de bibliothèques clone et le séquençage.
Protocole
1. Traitement des échantillons d'eau
- Filtrer l'eau 10L de l'environnement grâce à une membrane filtrante à pores um de taille pour enlever les grosses particules et bacteriovores. Recueillir le filtrat de l'eau dans une bonbonne.
- Transfert de 36 ml de chaque filtrat dans 3 tubes Eppendorf stériles (50 ml) contenant 4 ml solution fraîchement préparée de paraformaldéhyde (PFA; 10%). Incuber pendant 2 heures à température ambiante pour préserver les cellules. Recueillir cellules sur 0,22 um de-la taille des pores des filtres à membrane blanche par filtration sous vide. Lavez le filtre en faisant passer 10 ml de tampon phosphate salin (PBS) à travers....
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Discussion
Notre approche de couples BrdU constitution, FACS et 16S ADNr pour permettre l'analyse des espèces au niveau d'identification du bactérioplancton qui métabolisent les composants individuels du DOC dans les milieux aquatiques. Le dosage de l'incorporation de BrdU étiquettes des cellules bactériennes en fonction des activités métaboliques, ce qui permet l'analyse uniquement sur les bactéries actives et ne comprennent donc pas des cellules dormantes. Dans notre approche, l'incorporation de BrdU est .......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Le financement de ce projet a été fournie par la National Science Foundation accorde OCE1029607 (XM) et MCB0702125 (au MAM) et la Gordon and Betty Moore Foundation (au MAM).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires | |
|---|---|---|---|---|
| Nom | Tapez | Société | Le numéro de catalogue | Commentaires |
| BrdU | Réactifs | Sigma | B5002-5G | |
| Le lysozyme | Réactifs | Sigma | L6876-5G | |
| Protéinase K | Réactifs | Sigma | P2308-25MG | |
| In Situ prolifération cellulaire Kit, fluos | Kit | Roche | 11810740001 | Consommer plus de l'Anti-BrdU-fluos et le tampon d'incubation par réaction que suggéré par le fabricant. |
| Chambres d'incubation Cadre-Seal | Matériau | Bio-Rad | FSL-1201 | |
| Polycarbonate filtres à membranes (142 mm de diamètre, 1,0 um-la taille des pores) | Matériau | Millipore | FALP14250 | |
| Filtres à membrane en polycarbonate (25 mm de diamètre, de 0,2 um-la taille des pores) | Matériau | Millipore | FGLP02500 | |
| illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Perles | Kit | GE Healthcare | 27-9559-01 | |
| QIAquick gel extraction kit | Kit | QIAGEN | 28704 | |
| FailSafe PCR System | Kit | EPICENTRE | FS99060 |
Références
- Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).
- Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J.
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Réimpressions et autorisations
