Article de méthode

Immobilisation bactérienne pour l'imagerie par microscopie à force atomique

DOI :

10.3791/2880

⸱

10 août 2011

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1Biological and Nanoscale Systems Group, Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 2Department of Biochemistry and Cellular and Molecular Biology, University of Tennessee , 3Department of Surgery, Eastern Virginia Medical School, 4Center for Nanophase Materials Sciences Division, Oak Ridge National Laboratory

Dans cet article

Résumé

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En direct des bactéries Gram-négatives et gram-positif peut être immobilisé sur la gélatine-mica et imagée dans un liquide en utilisant la microscopie à force atomique (AFM).

Résumé

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L'AFM est une haute résolution (échelle nm) outil d'imagerie que les sondes mécanique d'une surface. Il a la capacité de cellules d'image et de biomolécules, dans un environnement liquide, sans la nécessité de traiter chimiquement l'échantillon. Afin d'atteindre cet objectif, l'échantillon doit suffisamment adhérer à la surface de montage afin de prévenir l'enlèvement par les forces exercées par la pointe de numérisation AFM. Dans de nombreux cas, l'imagerie succès dépend de l'immobilisation de l'échantillon à la surface de montage. Idéalement, l'immobilisation devrait être minimalement invasive à l'échantillon de telle sorte que les processus métaboliques et attributs fonctionnels ne sont pas compromises. En revêtement de surfaces mica fraîchement clivé par porcine (porc) de gélatine, les bactéries chargées négativement peuvent être immobilisés sur la surface et imagée dans le liquide par l'AFM. Immobilisation des bactéries sur la gélatine mica est très probablement due à l'interaction électrostatique entre les bactéries chargées négativement et la gélatine chargée positivement. Plusieurs facteurs peuvent interférer avec immobilisation bactérienne, y compris les constituants chimiques du liquide dans lequel les bactéries sont suspendues, le temps d'incubation de la bactérie sur les caractéristiques de gélatine mica recouvert de surface, de la souche bactérienne et le milieu dans lequel les bactéries sont imagés. Globalement, l'utilisation de gélatine-mica se trouve être généralement applicables pour l'imagerie des cellules microbiennes.

Protocole

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1. Préparation de Mica:

  1. Couper le mica (Sciences Electron Microscopy) avec des ciseaux à la taille nécessaire pour s'adapter au microscope AFM (env. 22 x 30 mm).
  2. Enchaînement du mica, des deux côtés, généralement avec du ruban pour enlever la couche extérieure, jusqu'à ce que lisse couches ininterrompue demeurent.

2. Préparation de la solution de gélatine:

  1. Ajouter 100 ml d'eau distillée à une bouteille de laboratoire.
  2. Faire chauffer le biberon au micro-ondes jusqu'à ce que l'eau commence à bouillir. (Si un micro-ondes n'est pas disponible, l'eau peut être chauffée dans un bécher sur une plaq....

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Discussion

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Différents facteurs peuvent affecter la cellule microbienne de montage et d'imagerie par AFM. La gélatine qui est utilisée pour le revêtement du mica est important. Commerce de gélatine est isolé à partir d'un certain nombre de vertébrés, y compris les poissons, les vaches et les cochons. L'origine et la méthode de traitement de déterminer la pertinence de la gélatine pour immobilisation bactérienne. De nombreuses sources et les types de gélatine ont été évalués pour leur efficacité dans les bactéries immobi.......

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

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Cette recherche est parrainée par le Bureau de recherche biologique et environnementale, ministère américain de l'Energie et par l'octroi de financement à partir du Commonwealth de la Virginie Conseil de recherche en santé. Oak Ridge National Laboratory est géré par UT-Battelle, LLC, pour le ministère américain de l'Énergie et du contrat No. DE-AC05-00OR22725.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom Société Numéro de catalogue
Gélatine Sigma, St. Louis, MO G6144, G2625 G2500 ou
Microscope à Force Atomique PicoPlus Agilent Technologies, Tempe, AZ
Cantilevers AFM Veeco, Santa Barbara, Californie MLCT-AUHW

Références

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  1. Bernal, R., Pullarkat, P. A. Mechanical properties of axons. Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).
  2. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
  3. Chetta, J., Kye, C.

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Mots-clés

Atomic Force MicroscopyBacterial ImmobilizationGelatin Coated MicaAFM ImagingLiquid EnvironmentPorcine GelatinMica PreparationBacterial SuspensionAFM Wet CellImaging Protocol

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