Nous présentons le protocole détaillé pour Agrobacterium induite par le virus du gène taire (VIGS) de dosage dans le coton. Le virus du rattle (VRT) vecteurs dérivés VIGS ont été déployés pour inciter RNA silencing de coton GrCLA1, alterados Cloroplastos une gène. Le phénotype albinos causés par faire taire GrCLA1 a été observée au stade plantule dans les 2 semaines après l'inoculation.
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Article de méthode
Agrobacterium induite par le virus Assay Gene Silencing En Coton
Dans cet article
Résumé
Résumé
Cotonnier (Gossypium hirsutum) est l'une des cultures les plus importantes dans le monde entier. Des efforts considérables ont été réalisés sur l'amélioration moléculaire des variétés nouvelles. L'analyse génétique à grande échelle fonctionnelle de coton a été en retard sur la plupart des espèces végétales modernes, probablement en raison de sa grande taille de la duplication du génome, le gène et la polyploïdie, cycle de croissance long et récalcitrant à la transformation génétique 1. Pour faciliter l'étude fonctionnelle à haut débit génétique / génomique dans le coton, nous essayons de développer des tests rapides et efficaces transitoires afin d'évaluer les fonctions des gènes de coton.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) est une technique puissante qui a été développé sur la base de l'hôte inactivation génique post-transcriptionnelle (PTGS) pour réprimer la prolifération virale 2,3. Agrobacterium VIGS a été appliquée avec succès dans un large éventail d'espèces dicotylédones telles que des Solanacées, Arabidopsis et des espèces de légumineuses, et des espèces monocotylédones dont l'orge, le blé et le maïs, pour diverses études génomiques fonctionnelles 3,4. Comme cette approche rapide et efficace évite la transformation des plantes et surmonte redondance fonctionnelle, il est particulièrement attrayant et adapté pour l'étude de génomique fonctionnelle chez les espèces de cultures comme le coton ne se prêtent pas à la transformation.
Dans cette étude, nous présentons le protocole détaillé du système d'Agrobacterium VIGS en coton. Parmi les vecteurs viraux plusieurs VIGS, le virus du rattle (VRT) envahit un large éventail d'hôtes et est capable de se propager à travers vigoureusement la plante entière encore produire des symptômes bénins sur le hosts5. Pour surveiller l'efficacité taire, GrCLA1, un gène homologue de Arabidopsis Cloroplastos alterados une gène (AtCLA1) en coton, a été cloné et inséré dans le code binaire VIGS vecteur pYL156. CLA1 gène est impliqué dans le développement des chloroplastes 6, et les études précédentes ont montré que perte de fonction de AtCLA1 abouti à un phénotype albinos sur les vraies feuilles 7, offrant un excellent marqueur visuel pour faire taire l'efficacité. À environ deux semaines après l'infiltration d'Agrobacterium, le phénotype albinos ont commencé à apparaître sur les feuilles vraies, avec une efficacité de 100% en silence toutes les expériences répétées. La réduction au silence l'expression des gènes endogènes a également été confirmée par analyse RT-PCR. De manière significative, pourrait faire taire puissamment se produisent dans tous les cultivars que nous avons testés, y compris les diverses variétés cultivées commercialement au Texas. Cette rapide et efficace au moyen d'Agrobacterium test VIGS fournit un outil très puissant pour rapide et à grande échelle d'analyse des fonctions des gènes au niveau de l'échelle du génome du coton.
Protocole
1. Pousser les semis de coton
- Semer les graines du coton upland (Gossypium hirsutum) variété Fibermax 832, Phytogen 425RF, Phytogen 480WR et Deltapine 90 dans des pots (7 cm de diamètre) contenant Metro Mix 700 (SunGR, Beavile, WA).
- Gardez les pots dans un plateau recouvert d'un dôme en plastique à 23 ° C, 120 uE m -2 s -1 lumière, avec une photopériode 12 heures heure de lumière/12 sombre dans une chambre de croissance.
- Retirez le dôme lorsque deux cotylédons ont émergé.
- Environ deux semaines plus tard, l'utilisation des plantes avec deux cotylédons sont entièrement développés pour le dosage VIGS. A ce stade, les v....
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Discussion
VIGS a été prouvé être un outil puissant dans l'analyse génomique fonctionnelle par transitoirement renversant l'expression de gènes endogènes. Dans cette étude, nous avons développé une VIGS Agrobacterium en utilisant un vecteur binaire basée VRT. Le coton CLA1 (GrCLA1) gène a été développé comme un repère visuel pour surveiller l'efficacité taire. Nous avons toujours obtenu 100% d'efficacité silençage génique, a démontré par le phénotype albinos apparaissant sur les feuilles vrai dans toutes l.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Nous sommes reconnaissants aux Drs. SP Dinesh Kumar et Yule-Liu pour TRV-VIGS vecteurs, et les Drs. Chuck Kenerley, Terry Wheeler, Jim Starr et Bayer CropScience pour fournir des semences de coton. Ce travail a été financé par la NSF à LS et les NIH à PH
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom des réactifs et des équipements | Société | Catalogue / numéro de série | Commentaires |
| Rouleau à tambour | Glas-Col, LLC. | 099A TC108 | Agro-bactérie de la culture |
| Incubateur | Sheldon Manufacturing, Inc | 01046209 | Agro-bactérie de la culture |
| UV / Vis spectrophotomètre | Beckman Coulter | Modèle: DU530 | Mesure OD |
| Gene Pulser | BioRad | Modèle: 1652076; de série: 154BR3880 | L'électroporation |
| Pulser contrôleur | BioRad | Modèle: 1652098; de série: 232BR4833 | L'électroporation |
| Micropulser électroporation cuvette | BioRad | 165-2081 | L'électroporation |
| Seringue de 1 mL | BD Biosciences | 30962 | L'inoculation de l'agro-bactérie |
| Metro Mix 700 | SUNGR | SKU # 553001 | Plantule croissance |
| Terra Cotta pot | TOPlastics | GPS 3001B2 | Plantule croissance |
| Monohydraté MES | USB | 18886 | Mémoire tampon d'infiltration |
| Acétosyringone | Sigma | D134406 | Mémoire tampon d'infiltration |
Références
- Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes. Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).
- Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. Virus-induced gene silencing. Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).
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