Lentivirus médiée par manipulation génétique et de visualisation des neurones sensoriels olfactifs In vivo</em

Résumé

Nous présentons une technique lentiviraux pour la manipulation génétique et la visualisation de simples axone neurone olfactif sensorielle et son arborisation terminale In vivo.

Résumé

Développement d'un circuit précis olfactive repose sur la projection précise de olfactifs sensoriels neurone (SVO) axones vers leurs cibles synaptiques dans le bulbe olfactif (OB). Les mécanismes moléculaires de l'OSN axone de croissance et de ciblage ne sont pas bien comprises. L'expression des gènes Manipulation et après la visualisation des axones OSN unique et leur terminal tonnelle morphologie ont été jusqu'à présent difficile. Pour étudier la fonction des gènes au niveau cellulaire unique dans un délai déterminé, nous avons développé une technique basée lentiviraux de manipuler l'expression des gènes dans les ARS in vivo. Particules Lentivirales sont livrés à ARS par microinjection dans l'épithélium olfactif (EO). Des cassettes d'expression sont alors définitivement intégré dans le génome des ARS transduites. Vert l'expression des protéines fluorescentes identifie ARS infectés et expose leur morphologie entier, y compris la tonnelle axone terminal. Grâce au temps de retournement court entre la micro-injection et la détection journaliste, les études de fonction du gène peut être porté dans un délai très étroite du développement. Avec cette méthode, nous avons détecté expression de la GFP dans aussi peu que trois jours et aussi longtemps que trois mois après l'injection. Nous avons atteint deux sur-expression et de médiation shRNA le knock-down par microinjection lentiviraux. Cette méthode fournit des morphologies détaillées des corps cellulaires et des axones OSN au niveau cellule unique in vivo, et permet ainsi la caractérisation de la fonction de gènes candidats au cours du développement olfactif.

Protocole

1. Préparation

Cette procédure est la biosécurité de niveau 2, donc toutes les préparations suivantes sont faites dans une hotte Biohazard où la procédure de micro-injection est réalisée.

1. Préparer et préchauffer à 37 ° C à eau: Remplissez un sac de rangement en plastique avec de l'eau - joint et mis sur un bloc de chauffage vidé incubateur. Cela permettra de récupérer les souris après l'injection.
2. Remplissez un récipient avec les déchets biologiques dangereux Javel à 10% à un volume adapté à l'immersion de tous les déchets de cette procédure.
3. Préparer un petit plat ouverte de 70% d'é....

Discussion

Microinjection des résultats lentivirus dans le transfert permanent de constructions de gènes dans l'ADN génomique OSN. Cette approche nous permet d'effectuer des manipulations à court terme ou à long terme de gènes candidats par surexpression ou la médiation shRNA le knock-down. En outre, nous pouvons par fluorescence étiquette ARS unique dans une lignée de souris transgéniques existantes pour observer la co-localisation des populations de récepteurs olfactifs. La microinjection est requis pour la transduction .......

Matériaux

Microinjection: souriceaux nouveau-nés ont été microinjectés l'aide d'une seringue Hamilton 5uL (Hamilton # 7647-01) munie d'une aiguille de calibre 33 (Hamilton # 7762-06).

Réactifs immunocytochimie: les anticorps primaires: GFP anticorps polyclonal de lapin (Molecular Probes # A-6455), l'anticorps polyclonal dirigé contre le poulet OMP (personnalisé) (Chen et al, 2005.), La Guinée cochon anticorps polyclonal contre VGlut2 (Millipore # AB2251). Anticorps secondaire: Cy2 conjugué d'âne anti-lapin (Jackson Immunolab # 711-225-152), Cy3 conjugué âne anti-poulet (Jackson Immunolab # 703-165-155) et Cy5-conjugués de chèvre anti-Guinée porc (Jackson Immunolab # 106-175-008). Les sections ont été montées sur des lames de verre avec Fluoromount G (Southern Biotech # 0010-01) avec 50ng/mL DAPI chromatine solution de teinture.

Imagerie confocale: Z-stack images ont été prises en utilisant un Olympus FV1000 Flouview microscope confocal et d'images collectées et traitées dans les projections en 3D en utilisant Olympus FV10-ASW 2.01 acquisition confocale et des logiciels d'analyse.