Lentivirus médiée par manipulation génétique et de visualisation des neurones sensoriels olfactifs In vivo</em

Résumé

Nous présentons une technique lentiviraux pour la manipulation génétique et la visualisation de simples axone neurone olfactif sensorielle et son arborisation terminale In vivo.

Résumé

Développement d'un circuit précis olfactive repose sur la projection précise de olfactifs sensoriels neurone (SVO) axones vers leurs cibles synaptiques dans le bulbe olfactif (OB). Les mécanismes moléculaires de l'OSN axone de croissance et de ciblage ne sont pas bien comprises. L'expression des gènes Manipulation et après la visualisation des axones OSN unique et leur terminal tonnelle morphologie ont été jusqu'à présent difficile. Pour étudier la fonction des gènes au niveau cellulaire unique dans un délai déterminé, nous avons développé une technique basée lentiviraux de manipuler l'expression des gènes dans les ARS in vivo. Particules Lentivirales sont livrés à ARS par microinjection dans l'épithélium olfactif (EO). Des cassettes d'expression sont alors définitivement intégré dans le génome des ARS transduites. Vert l'expression des protéines fluorescentes identifie ARS infectés et expose leur morphologie entier, y compris la tonnelle axone terminal. Grâce au temps de retournement court entre la micro-injection et la détection journaliste, les études de fonction du gène peut être porté dans un délai très étroite du développement. Avec cette méthode, nous avons détecté expression de la GFP dans aussi peu que trois jours et aussi longtemps que trois mois après l'injection. Nous avons atteint deux sur-expression et de médiation shRNA le knock-down par microinjection lentiviraux. Cette méthode fournit des morphologies détaillées des corps cellulaires et des axones OSN au niveau cellule unique in vivo, et permet ainsi la caractérisation de la fonction de gènes candidats au cours du développement olfactif.

Protocole

1. Préparation

Cette procédure est la biosécurité de niveau 2, donc toutes les préparations suivantes sont faites dans une hotte Biohazard où la procédure de micro-injection est réalisée.

1. Préparer et préchauffer à 37 ° C à eau: Remplissez un sac de rangement en plastique avec de l'eau - joint et mis sur un bloc de chauffage vidé incubateur. Cela permettra de récupérer les souris après l'injection.
2. Remplissez un récipient avec les déchets biologiques dangereux Javel à 10% à un volume adapté à l'immersion de tous les déchets de cette procédure.
3. Préparer un petit plat ouverte de 70% d'éthanol et d'un second plat avec ddH2O stérilisés et les placer dans l'enceinte de sécurité biologique.
4. Stériliser une capacité 5uL seringue Hamilton avec une aiguille de calibre 33 par pulvérisation bas du corps et de l'aiguille avec de l'éthanol à 70% avec le plongeur a sorti tout le chemin. À plusieurs reprises aspiration d'éthanol à partir du plat et d'éjecter tout le chemin au moins 5 fois.
5. Rincer la cartouche seringue en aspirant l'eau stérile et l'éjection d'au moins 5 fois. Placez la seringue en toute sécurité de côté dans le capot de la culture et de lui permettre de sécher.
6. Retirer des stocks viraux de -80 stockage ° C et congélateur placer sur la glace pour permettre à la décongélation. Microinjection nécessite 2μL du stock de virus par souris à un titre de 10 ⁹ unités infectieuses / ml. Les lentivirus peuvent être obtenus auprès de sources commerciales ou produites dans le laboratoire selon le protocole établi (Loïs et al., 2002).
7. Préparer une étape d'injection qui fournit une zone surélevée au-dessus de la surface du capot - peut utiliser une boîte de culture 10cm recouvert d'une feuille de Kimwipe.
8. Organiser des lingettes alcoolisées à proximité de la station d'injection.

2. Microinjection de particules lentiviral dans l'épithélium olfactif

Toutes les procédures réalisées sur l'animal dans cette méthode sont faites conformément aux lignes directrices approuvées IACUC. Le Mus musculus souche C57BL/6J est le modèle animal utilisé dans toutes les expériences ont démontré ici.

1. Anesthésier souriceaux par hypothermie en prenant une souris chiot (P0-P3) hors de la cage et mettre le chiot sur un gant de coupe ouverte sur la glace pendant 5 minutes.
2. En attendant que le chiot à être entièrement anesthésié, 2μL aspiration du stock viral dans la seringue stérilisée Hamilton.
3. Placez la souris chiot au sommet de la phase d'injection. Tirez doucement sur la peau loin du sommet de la tête à l'oreille vers le haut de la nuque. Cela devrait fournir une surface de peau appris au cours de la cavité nasale et la facilité d'injection.
4. Insérez l'aiguille à travers la partie supérieure de la cavité nasale environ 3mm en dessous de la surface de la peau pour atteindre l'épithélium olfactif. Microinject 0.5μL de solution virus par coup, en choisissant deux sites de chaque côté, à gauche et à droite (quatre injections au total par la souris = 2μL de virus nécessaire). Les sites d'injection doivent être décalés les uns des autres. Pour cibler des sites d'injection, de rechercher la surface du crâne dorsale pour le contour du bulbe olfactif. Cette ligne est à peine visible à la naissance par la peau semi-translucide et le crâne. Pour faire deux injections par côté, l'objectif d'une injection juste rostrale à un aperçu ampoule à un axe médian. Faire de l'insertion latérale secondes au contour ampoule, assurez-vous encore à l'angle de l'injection médiale afin que vous puissiez atteindre l'épithélium olfactif qui réside ventralement au-dessous de l'ampoule. Éviter de pénétrer le bulbe olfactif!
5. Sécher toute solution virale résiduelle ou de sang qui peut s'échapper du site d'injection ou les ouvertures de la narine avec un Kimwipe. Jeter immédiatement Kimwipes dans le récipient eau de javel diluée Biohazard.
6. Placez la souris injectées sur le lit à eau incubateur.
7. Répétez les étapes 1-4 pour toutes les souris pour être injecté, se souvenant que vous aurez besoin d'environ 2μL du stock de virus par souris.
8. Laissez-souris de récupérer sur le matelas d'eau incubateur pendant 30 minutes avant de les retourner dans leur cage de ponte d'origine.
9. Disposer de l'étape de micro-injection, lingettes désinfectantes et tous les produits du papier de nettoyage supplémentaire dans l'élimination de Javel risque biologique.
10. Nettoyer la seringue Hamilton par aspiration répétée et l'éjection de l'éthanol, puis l'eau comme cela se fait dans les étapes de préparation. Laisser la seringue à sécher.
11. Pour une efficacité maximale de transduction répéter cette procédure à nouveau en 4 heures. ARS infectés peuvent être visualisées sur toute la longueur de la cellule en aussi peu que trois jours.

3. L'immunohistochimie de flotter sections bulbe olfactif

1. Sacrifice de la souris injectées au point dans le temps désiré et la perfusion fixer le tissu avec du paraformaldéhyde 4%. Disséquer l'OB. Incuber dans paraformaldéhyde nuit, puis saccharose à 30% en PBS pendant une nuit. Intégrer dans les PTOM sur milieu d'inclusion de la glace sèche.
2. Coronales sections OB sont obtenus à un 60μm d'épaisseur en utilisant un cryostat. Balayer sections ampoule dans une boîte de culture 10cm avec 5mL 1x PBS (pH 7,4). Les articles doivent être conservés flottant dans du PBS pour permettre PTOM dissolve. Transfert sections flottantes et PBS dans un flacon de 50 ml conique.
3. Autoriser sections pour se déposent au fond du flacon. Vide hors PBS sans aspirer toutes les sections. Rincer les coupes de tissus avec 20 ml de PBS. Répétez les étapes s'installer et passer l'aspirateur. Resuspendre tissus avec 10 mL de PBS et de transfert de sections flottantes dans un flacon de 15 ml conique pour immunocoloration. Une fois les coupes de tissus sont installés, aspirateur hors du PBS surnageant sans déranger les tissus. Sections Resuspendre avec 0,3% de Triton X-100 dans du PBS 1X, pH 7,4 (PBS-Tx) permettant de détergent pour perforer les membranes cellulaires. Incuber 10 minutes à température ambiante. Vide le surnageant et l'incubation répéter avec PBS-Tx deux fois.
4. Incuber les coupes de tissus dans 10 ml de solution de blocage (sérum de cheval à 5% dans du PBS-Tx) pendant deux heures à température ambiante.
5. Rincer la solution de blocage d'au moins deux fois avec du PBS-Tx de 15 minutes chacune à la température ambiante.
6. Préparer 2mL d'une solution d'anticorps primaire dans du PBS-Tx. Voir la section Réactifs et équipements pour les anticorps utilisés dans cette expérience.
7. Remplacer seconde PBS-Tx lavez blocage avec une solution d'anticorps primaire. Incuber sur une plate-forme à bascule lentement (~ 30rpm) à 4 ° C pendant 24-48 heures pour assurer une pénétration en profondeur dans les sections 60μm flottant.
8. Après incubation, la solution d'anticorps primaires peuvent être récupérées avec soin en utilisant une pipette et conservés à 4 ° C pour les réutiliser jusqu'à deux fois plus dans les deux semaines sans aucune perte significative de l'intensité de la coloration.
9. Lavez sections à trois reprises dans du PBS-Tx de 20 minutes chacune à température ambiante avec une légère rotation (~ 30rpm).
10. Préparer 2mL de dilution anticorps secondaire dans du PBS-Tx. Aspirer le dernier lavage et ajouter une solution d'anticorps secondaire à des coupes de tissus. Enveloppez l'extérieur du flacon coloration dans du papier aluminium pour bloquer la lumière, qui peut causer photoblanchiment fluorophore. Placez enveloppé flacon sur une plate-forme à bascule lentement et laisser incuber à 4 ° C pendant la nuit.
11. Jeter la solution d'anticorps secondaire par aspirateur loin. Lavez sections fois avec du PBS-Tx de 20 minutes chacune à la température ambiante. Rincer deux fois supplémentaires avec du PBS (pH 7,4) pendant 20 minutes chacune à la température ambiante. Montez les sections de tissu taché sur des lames de verre à l'aide Fluoromount G.
12. Ecran à travers des sections colorées pour les axones OSN positive infectés et Termini axone avec un microscope à fluorescence.
13. Pour construire une vue en trois dimensions d'une étiquette axone OSN et le terminal tonnelle, faire une série de sections optiques grâce à la profondeur de la tranche de 60μm tissu cible OB (le long de l'axe z) en utilisant la microscopie confocale.
14. Cet empilement de Z-section des images peuvent ensuite être projetées ensemble pour reconstruire une perspective de 360 ​​° de rotation d'un seul axone étiquetés OSN, dont la borne tonnelle en détail dans son intégralité. Toute l'angle d'une rotation unique peut être capturé et exporté comme un fichier image (par exemple JPG, TIFF) pour la présentation format 2D.

4. Les résultats représentatifs

Avec les méthodes décrites ici, nous pouvons transduire des neurones sensoriels olfactifs par les lentivirus in vivo. Nous avons jusqu'ici visualisés ARS infectés avec la GFP et les journalistes mCherry fluorescente, aussi bien avec un myc-taggés protéine de fusion via immunocytochimie. Cette technique fournit une abondance d'ARS infectés. Pourtant, la transduction survient sporadiquement suffisante pour fournir ARS étiquetées individuellement, permettant ainsi l'analyse de la morphologie cellulaire unique. Axones et terminaisons axonales sont imagés dans les coupes de tissus au milieu OB leur environnement naturel par microscopie confocale (figure 1). L'ensemble du SVO axone terminal de tonnelle peut généralement être captivé dans une section de 40 50 microns optique. Fort grossissement d'infectés terminaisons axonales OSN permet une analyse détaillée de la morphologie axonale tonnelle à la couche glomérulaire.

Figure 1. Trajectoire de simples olfactifs sensoriels axone des neurones et sa tonnelle terminal. A) une coupe coronale du bulbe olfactif de souris P7 montrant la couche nerf olfactif (ONL) immunocolorées pour OMP (rouge) et la couche glomérulaire (GL) immunocolorées avec deux OMP et Vglut2 (gris). Un seul axone des neurones sensoriels olfactifs exprimant la GFP (vert) se déplace au sein de l'ONL et pénètre dans la structure glomérulaire. B) L'axone terminal de la morphologie Arbor dans le glomérule clairement mis en évidence par expression de la GFP. Vglut2 co-coloration en gris illumine la surface totale glomular dans lequel la GFP-positives axone élabore une avor terminal. C) lentiviraux ARS infectées exprimant la GFP (green) pour l'ENP. Le cytostructure de l'épithélium olfactif est montré avec coloration DAPI (bleu). Expression de la GFP permet de visualiser les corps cellulaires OSN et leur processus cellulaires pour l'ENP. D) Un axone OSN et sa morphologie terminal avec l'expression Rap1GAP2 le knock-down par shRNA. Les lentivirus portant une cassette d'expression double avec Rap1GAP2 shRNA sous le promoteur U6 et la souris GFP sous unePromoteur CMV ont été appliqués à l'ENP. Infected terminaisons axonales olfactifs présentaient un terminal plus simplifiée tonnelle par rapport à celle du contrôle GFP seule. Barre = 20μm.

Discussion

Microinjection des résultats lentivirus dans le transfert permanent de constructions de gènes dans l'ADN génomique OSN. Cette approche nous permet d'effectuer des manipulations à court terme ou à long terme de gènes candidats par surexpression ou la médiation shRNA le knock-down. En outre, nous pouvons par fluorescence étiquette ARS unique dans une lignée de souris transgéniques existantes pour observer la co-localisation des populations de récepteurs olfactifs. La microinjection est requis pour la transduction ...

Matériaux