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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Créer un modèle de souris de type SOPK
REMARQUE : Les souris utilisées dans cette étude étaient d’origine mixte (C57/B6, CD1, 129Sv) et ont été maintenues avec de la nourriture et de l’eau ad libitum dans un cycle lumière/obscurité de 14/10 h à 24 °C.
- Préparation des granulés de DHT
- Tubulure silastique autoclave à stériliser. Coupez des tubes de silastic à une longueur de 15 mm avec une lame de rasoir.
- Scellez un côté en injectant du silicone adhésif médical dans le tube à l’aide d’une aiguille émoussée de 20 g fixée à une seringue de 3 ml. Le piston doit être retiré de la seringue, puis l’adhésif inséré dans le réservoir. Le piston est réinséré et l’adhésif est poussé vers le bas jusqu’à ce qu’il commence à sortir de l’aiguille. L’aiguille émoussée est fabriquée en coupant le côté pointu de l’aiguille de 20 G avec des ciseaux puissants. La longueur du silicone dans le tube doit être supérieure à 2 mm pour permettre la coupe en post-production.
- Sécher toute la nuit ; vérifier s’il y a des bulles d’air du côté scellé. Ceux qui n’ont pas de bulles d’air sont utilisés pour les granulés DHT. D’autres peuvent être utilisés pour les granulés de contrôle sans DHT.
- Portez des gants, un masque, des lunettes de protection et une blouse de laboratoire avant de fabriquer des granulés de DHT dans une cagoule pour éviter l’exposition à la DHT de la peau.
- Versez la poudre DHT dans un bateau de pesée en plastique et appuyez sur le côté ouvert des tubes recouverts d’adhésif (produit en 1.1.1) dans la poudre DHT.
- La poudre DHT peut être tassée à l’aide d’un gros trombone qui est redressé. Continuez jusqu’à ce que DHT atteigne une hauteur de 4 mm (ou la longueur souhaitée). Vérifiez la longueur de la DHT à l’aide d’une règle et scellez le côté ouvert avec du silicone, séchez-le pendant la nuit.
- Coupez chaque côté scellé pour faire une longueur de silicone de 2 mm. La longueur totale du plomb sera de 8 mm.
- Scellez les deux côtés du tube silastique vide en tant que pastille de contrôle (sans DHT).
- Conservez les granules dans un tube conique de 50 ml enveloppé d’une feuille d’aluminium (pour éviter l’exposition à la lumière) à température ambiante jusqu’à utilisation. Les granulés DHT conservent leur pleine efficacité pendant au moins 3 mois de stockage.
- Insertion et remplacement de la DHT
- Jusqu’à 20 granules de DHT ou pastilles témoins sont immergées séparément dans un tube conique de 50 mL avec 30 mL de solution saline stérile à 0,9 % pendant 24 h à 37 °C pour l’équilibrage juste avant l’insertion.
- Avant l’intervention chirurgicale, les surfaces et les gants sont désinfectés à l’aide de clidox et les surfaces de travail sont recouvertes d’un papier absorbant propre à dos de plastique (tampon chirurgical). Tous les instruments qui entrent en contact avec les animaux sont décontaminés avant d’entrer dans l’animalerie par autoclavage. Les instruments doivent sécher et refroidir avant d’être utilisés.
- Des souris femelles de 2 mois sont utilisées (4 à 5 souris/cage). Des souris reçoivent une injection intrapéritonéale de xylazine (3,5 mg/kg p.c.) et de kétamine (78,8 mg/kg p.c.) à l’aide d’une seringue à insuline. Les calculs pour le mélange et le dosage de l’anesthésie sont présentés au tableau 1.
- Une fois qu’une anesthésie adéquate est obtenue, mesurée par la perte du réflexe de l’orteil et le ralentissement de la respiration, la souris sera préparée pour la chirurgie.
- Désinfectez la peau de la zone avec de la bétadine à l’aide d’une gaze stérile et nettoyez avec de l’éthanol à 70 %. La zone sera à nouveau peinte avec de la bétadine.
- Découpez un trou d’environ 5 mm de long avec des ciseaux sous la peau près du cou. À l’aide d’un trochar de 10 G, faites un petit tunnel (15 mm) dans le sens rostral. La pastille est insérée dorsalement avec le trochar.
- L’ouverture est ensuite scellée avec un adhésif chirurgical. Approchez manuellement les bords de la plaie à l’aide d’une pince et de coups de brosse doux pour appliquer une fine pellicule d’adhésif liquide sur les bords approximatifs de la plaie. Accumulez 3 fines couches d’adhésif pour vous assurer que l’adhésif est uniformément réparti sur la plaie. L’adhésif doit s’étendre de 1 cm de chaque côté des bords de la plaie apposée. Des clips de suture ou chirurgicaux peuvent également être utilisés pour fermer le trou. Remettez les souris dans une cage, logée individuellement, avec un coussin chauffant pour la récupération. Remplacez la pastille toutes les 4 semaines pour maintenir un niveau constant d’exposition aux androgènes. Le granulé d’origine sera retiré et le nouveau granulé sera inséré comme décrit ci-dessus, dans une position similaire.
| kétamine
(100 mg/mL)
| Xylazine
(100 mg/mL)
| salin
(0,9 %)
|
| 175 μL | 15 μL | 810 μL |
| Injection intrapéritonéale de solution de travail : 0,1 mL/20g de poids corporel |
Tableau 1. Cocktail kétamine/xylazine.