Préparation d’organoïdes à partir de tumeurs : un modèle tumoral 3D in vitro

Les procédures animales décrites ici ont été effectuées avec l’approbation de l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Department of Laboratory Animal Resources, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, New York.

NOTE : Les souris mâles à disséquer pour isoler la prostate ou les tumeurs de la prostate pour la génération d’organoïdes doivent avoir au moins atteint l’âge de la maturité sexuelle - environ 8-10 semaines. L’âge spécifique des souris peut varier d’une étude à l’autre. Parmi les facteurs à prendre en compte lors du choix de l’âge, citons les changements liés à l’âge dans les populations de cellules de la prostate, l’expression en fonction de l’âge de transgènes Cre spécifiques induits par le promoteur et le taux de progression de la tumeur de la prostate dans un GEMM particulier.

REMARQUE : La figure 1 montre une description illustrée de la procédure de génération d’organoïdes tumoraux.

1. Préparation

1. Préparez un organoïde de la prostate de souris selon Drost et al. avec les modifications suivantes. Utilisez un milieu conditionné au lieu de protéines recombinantes pour Noggin et R-Spondin et utilisez une concentration finale de 1 % (v/v), au lieu de 10 %, pour les milieux conditionnés par Noggin et R-Spondin.
   REMARQUE : Les cellules HEK293 transfectées de manière stable avec Noggin-Fc de souris HA ou Rspo1-Fc de souris HA sont utilisées pour produire respectivement un milieu conditionné à Noggin ou R-Spondin. Ces lignées cellulaires ont été offertes par le laboratoire Calvin Kuo de l’Université de Stanford.
2. Préparez la solution de digestion dans un tube de 15 mL en diluant 20 mg/mL de collagénase II avec un milieu Advanced DMEM/F12(+++) jusqu’à une concentration finale de 5 mg/mL. Ajouter l’inhibiteur de roche Y-27632 à la solution de collagénase II à une concentration finale de 10 μM.
   REMARQUE : Le rapport entre le tampon de digestion et le tissu est de 1 mL à 50 mg, que nous utilisons selon Drost et al.

2. Émincement et digestion du tissu tumoral

1. Dans la hotte de culture cellulaire, placez le tissu tumoral de la prostate dans une boîte de culture stérile de 10 cm, disséquez et jetez le tissu nécrotique.
2. Émincez le tissu tumoral de la prostate restant en cubes de^{1 mm 3} en tenant les morceaux de tissu avec la pince incurvée stérile et en coupant avec des ciseaux de dissection.
3. Placez les morceaux de tumeur hachés dans le tube de 15 mL avec le tampon de digestion en les ramassant avec le côté incurvé de la pince. Digérer le tissu tumoral à 37 °C en agitant pendant 1,5 à 2 h. Vérifier la progression de la digestion toutes les 20 min.
   REMARQUE : À ce moment, retirer au moins 2 ml de matrice de stockage à -20 °C et décongeler sur de la glace. 1 mL d’aliquotes de matrice mettront environ 3 h à décongeler.
4. Après la digestion des tissus, centrifuger le tube à 175 x g pendant 5 min à 4 °C pour former une pastille cellulaire.
5. Retirez le surnageant, agitez le tube pour détacher la pastille cellulaire et remettez la pastille en suspension dans 1 mL de trypsine préchauffée complétée par 10 μM d’inhibiteur de roche Y-27632. Mettez le tube dans un bain-marie à 37 °C pendant 5 min.
6. Après l’incubation, pipetez 5 fois vers le haut et vers le bas avec une pointe standard P1000. Remettez le tube à 37 °C au bain-marie pendant encore 5 minutes et répétez l’étape 2.6.
   REMARQUE : À ce moment de la procédure, réchauffez une boîte de culture cellulaire stérile à 6 puits en la plaçant dans un incubateur à 55 °C.

3. Comptage des cellules et remise en suspension dans la matrice

1. Lavez les cellules en ajoutant 9 mL d’AdDMEM/F12(+++) froid et centrifugez le tube à 175 x g pendant 5 min à 4 °C.
2. Après la centrifugation, retirez le surnageant, agitez le tube pour détacher la pastille et lavez à nouveau les cellules en ajoutant 10 mL d’AdDMEM/F12(+++) froid. Centrifuger le tube à 175 x g pendant 5 min à 4 °C.
3. Après la centrifugation, retirer le surnageant, agiter le tube pour détacher la pastille, remettre les cellules en suspension dans 1 mL d’AdDMEM/F12(+++) et compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre selon la procédure standard.
4. Sept à huit dômes s’insèrent dans un puits d’un plat à 6 puits lorsque les organoïdes sont plaqués dans la matrice de manière goutte à goutte. Environ 200 μL de matrice produiront 7 à 8 dômes. Décidez du nombre de puits d’organoïdes nécessaires à des fins expérimentales futures et calculez le volume de matrice requis. Ensuite, calculez le volume de solution contenant des cellules nécessaire pour avoir une concentration finale de 1,0 x 10⁶ cellules/mL de matrice.
5. Après avoir compté les cellules, centrifuger à 175 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant, agiter le tube pour détacher la pastille et remettre en suspension les cellules dans le volume de matrice calculé à l’étape 3.4.
   REMARQUE : La matrice ne reste sous forme liquide qu’à 4 °C ; Gardez les tubes matriciels et les solutions matricielles sur la glace en tout temps.

4. Dômes de matrice de placage et application des milieux

1. Mélangez la solution matrice-cellule avec une pipette P200 pour répartir uniformément les cellules sans introduire de bulles. Retirez la boîte de culture à 6 puits de l’incubateur à 55 °C.
2. Pipetez soigneusement 200 μL de solution matrice-cellule et déposez rapidement la solution dans un puits pour créer des dômes.
3. Répétez l’étape 4.2 jusqu’à ce que le volume de la solution de cellules matricielles soit épuisé. Laisser les dômes se solidifier à température ambiante pendant 2 min.
4. Retournez le plat à 6 puits et placez-le dans un incubateur à 37 °C pour poursuivre la solidification pendant 20 min.
5. Après l’incubation, ajoutez 2 ml de milieu organoïde prostatique de souris dans chaque puits. Ajouter l’androgène synthétique R1881 dans chaque puits pour une concentration finale de 1 nM et l’inhibiteur de roche Y-27632 à une concentration finale de 10 μM. Mélanger soigneusement et placer la plaque dans un incubateur à 37 °C pour la culture.
   REMARQUE : Le milieu de culture d’organoïdes doit être complété par un inhibiteur de roche 10 μM Y-27632 pendant seulement 1 semaine après la génération des organoïdes.

Figure 1 : Organigramme du protocole de génération d’organoïdes tumoraux de la prostate. Après avoir disséqué la tumeur de la prostate, coupez le tissu en morceaux de 1 mm. Digérez les morceaux de tumeur dans la collagénase, collectez les cellules et digérez dans la trypsine pour obtenir une suspension de cellule unique. Après le comptage des cellules, remettre en suspension dans le volume de matrice requis pour une concentration decellules de 1,0 x 10 6 cellules/mL. Dresser les dômes dans le plat en utilisant une méthode goutte à goutte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.