Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation
- Préparation des solutions et des milieux de culture
- Préparez tous les milieux de culture et tampons conformément à la table des matériaux.
- Préparation des instruments
- Mettre en place un bain-marie (>10 L) à 42 °C, une pompe péristaltique à vitesse variable et des pinces pour tenir les flacons. Préparez des ciseaux incurvés et des pinces (Figure 1).
- Sur le bain-marie ou à proximité, installez une plaque à pâtisserie (environ 38 x 26 cm) avec un tampon en polystyrène (grille conique de 50 ml), recouvert d’un sous-tampon absorbant coupé en un morceau de 20 x 20 cm (figure 1).
- Placez un morceau de ruban adhésif (5 à 8 cm) à proximité. Placez à proximité un fil à coudre en polyester de 20 cm, coupé et prêt à l’emploi. Procurez-vous un cathéter en plastique à l’aide d’une aiguille rétractable (7 mm x 19 mm, figure 1).
- Préparation de la verrerie
- À l’aide de pinces, placez et immobilisez dans le bain-marie une fiole de 1 L contenant 200 ml de 1x PBS avec un bouchon contenant deux pipettes de 1 ml introduites dans la solution. Le bouchon en caoutchouc est cranté pour permettre la recirculation du fluide en circuit fermé.
- À l’aide d’une autre pince, placez une fiole de 125 mL contenant 45 mL de tampon 2 ainsi qu’un bouchon muni de deux pipettes de 1 mL, dont l’une se trouve dans le liquide près du fond du ballon et l’autre qui reste au-dessus du liquide et souffle de l’oxygène dans le ballon.
note: Chaque pipette dans les bouchons aura un adaptateur à déconnexion rapide attaché à l’extrémité pour faciliter le changement de tube. L’oxygène s’écoulera doucement dans les deux flacons via la pipette dans le bouchon qui n’est pas immergé dans le liquide.
- Réservez deux plats de cristallisation stériles.
2. Procédure sur l’animal
- Réchauffez les solutions de PBS et de tampon 2 à 42 °C dans le bain-marie et faites circuler le PBS pendant au moins 20 ml/min dans la tubulure en circuit fermé pour maintenir les conduites de liquide chaudes. Immergez tout excès de tube dans le bain-marie pour qu’il reste aussi près que possible de 42 °C. Égouttez l’extrémité mâle du tube dans le ballon de 1 L contenant du PBS.
- Placez une boule de coton sur le sous-tampon absorbant et ajoutez environ 2 ml d’isoflurane à 30 % (composé de polyéthylène glycol 200 qui diminue le taux d’évaporation de l’isoflurane) sur la boule de coton à l’aide d’une pipette de transfert.
- Prenez la souris par la queue, placez-la dans l’une des boîtes de cristallisation, puis retournez rapidement la boîte sur la boule de coton afin que la souris ait un petit espace dans lequel inhaler l’anesthésie. Observez le rythme respiratoire de la souris et assurez-vous qu’elle est effectivement sous anesthésie.
note: Le rythme respiratoire doit être plus lent et plus profond, la queue flasque et les pattes non réactives au test de pincement sous anesthésie ; voir les directives de l’IACUC pour plus de détails.
- Pendant que la souris est sous anesthésie (cela prend 1 à 2 min), préparez le baril d’une seringue de 10 ml en retirant le piston et en insérant une petite boule de coton. Ajoutez 1 à 2 ml d’isoflurane à 30 % à l’aide d’une pipette de transfert dans la boule de coton à l’intérieur du baril et placez le baril à extrémité ouverte sur une table en attendant que la souris perde connaissance.
- Retirez rapidement le plat de cristallisation, retournez la souris sur son dos et placez le corps de la seringue sur son nez. Vérifiez deux fois la fréquence respiratoire, le pincement des orteils et la queue flasque. Toute réponse au pincement de l’orteil et à la queue flasque indique que la souris n’est pas complètement sous anesthésie. Gardez le canon de la seringue sur le museau pour maintenir l’inconscience.
- Placez des punaises dans les pattes de la souris, avec les membres tendus en position couchée. Mouillez l’abdomen et la cage thoracique avec 70 % d’isopropanol ou d’éthanol.
- Avec la pince droite dans une main, soulevez la peau près de la base de l’abdomen. Avec des ciseaux dans l’autre main, coupez la peau de la tente et le péritoine. L’incision doit être horizontale ou à la base de la peau de la tente. Assurez-vous de couper toutes les couches de la peau et du péritoine afin d’accéder à l’intestin. Coupez latéralement autour de l’abdomen jusqu’à la cage thoracique des deux côtés sans entailler aucun des organes.
- Coupez le lambeau de peau en coupant à travers la cage thoracique inférieure. Déplacez les intestins vers la droite avec l’arrière de la pince pour exposer la veine porte.
note: L’hémorragie de l’animal doit être minimale ; L’animal doit toujours respirer et être sous anesthésie profonde.
- Placez la pince incurvée fermée sous la veine porte entre le foie et la veine pancréaticoduodénale supérieure (flèche de la figure 2).
- Ouvrez la pince sous la veine porte. Saisissez le fil et tirez-le avec précaution de manière à ce qu’il soit centré sous la veine porte. Faites un nœud plat autour de la veine du portail sans la serrer.
- Placez la pince incurvée sous la veine porte et tirez-la doucement vers la queue de la souris pour redresser la veine (Figure 3A).
- Avec le cathéter dans l’autre main, placez le biseau de l’aiguille face vers le haut et parallèlement à la partie inférieure de la veine porte près de la pince (Figure 3B).
- Percez doucement la veine avec l’aiguille (Figure 3C). Assurez-vous que le biseau de l’aiguille est dans la lumière de la veine. Rétractez l’aiguille à ressort et continuez à pousser le cathéter en polymère dans la veine jusqu’à ce que le biseau soit près de la zone ramifiée veineuse. C’est dans le foie. Si le cathéter est correctement placé, un reflux de sang sera visible. (Figure 3D).
- Serrez le nœud plat et tirez-le vers le bas sur le cathéter pour aider à le stabiliser. Baissez immédiatement le débit de la pompe de 20 mL/min à 4 mL/min et coupez un autre vaisseau sanguin important pour le drainage. Coupez l’aorte abdominale pour un résultat optimal.
- Placez l’extrémité mâle de la tubulure sur l’extrémité femelle du cathéter (Figure 4A). Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la conduite. Veillez à ce que le cathéter ne soit pas poussé dans le foie ou hors de la veine. La mise en place du fil n’est pas essentielle, bien qu’elle aide à prévenir le reflux hors de la veine et aide à maintenir le cathéter dans la bonne position (Figure 4B, C).
- Utilisez du ruban adhésif pour immobiliser le tube sur le coussin. À l’aide de la pince droite, pressez le vaisseau sanguin de l’effluent afin de gonfler le foie à quelques reprises pour vous assurer que tout le sang s’est écoulé (figure 4D).
note: Le ruban de laboratoire standard peut ne pas fonctionner ; Cependant, le ruban de masquage restera collé au sous-tapis, même dans des conditions humides.
3. Perfusion hépatique
- Pendant que le foie est rincé avec du PBS, mesurez environ 24 mg de collagénase de type IV et placez-le dans le flacon contenant 45 ml de tampon 2 dans le bain-marie. Assurez-vous de faire tourner le liquide dans le ballon de manière à ce que la collagénase soit complètement dissoute et de remettre le flacon dans la pince de sorte que la partie contenant le liquide du ballon soit complètement immergée dans l’eau.
- Observez le changement de couleur du foie lorsqu’il est rincé avec du PBS. Changer le tube d’évacuation de la fiole de 1 L à la fiole de 125 mL. Ne laissez pas les bulles d’air s’écouler dans le foie.
- Une fois que le tampon de perfusion atteint le foie, serrez brièvement le vaisseau sanguin de l’effluent pour accumuler une certaine pression à l’intérieur du vaisseau et permettre à ce liquide de remplir tous les lobes du foie. Assurez-vous de ne pas interrompre le drainage trop longtemps, car cela pourrait faire éclater le mince tissu conjonctif entourant le foie (capsule de Glisson) et détruire la perfusion ou l'écoulement du liquide dans le lit capillaire du foie.
- Laisser le tampon 2 contenant de la collagénase perfuser dans le foie jusqu’à ce que les 45 mL aient coulé dans le tissu.
note: En cas de succès, la capsule de Glisson doit être séparée du parenchyme ou du tissu hépatique et le foie lui-même doit apparaître amorphe.
- Ajoutez environ 10 ml de tampon 1 dans l’autre plat de cristallisation et placez-le à côté de la souris.
- Retirez le cathéter et éteignez la pompe.
- Avec la pince droite et les ciseaux, coupez le foie de la souris. Si la digestion de la collagénase a été très efficace, il peut être nécessaire d’avoir une cuillère propre et stérile à portée de main pour prélever le foie de la souris et le placer dans le tampon 1.
