Ciblage fonctionnalisé du cancer de l’ovaire par nanoparticules fonctionnalisées : une technique pour faciliter l’absorption de l’agent de contraste nanoparticulaire conjuguée à l’acide folique par les cellules cancéreuses de l’ovaire

Résumé

Source : Lusk, J. F. et al. Détection du cancer de l’ovaire à l’aide de la cytométrie en flux photoacoustique. J. Vis. Exp. (2020)

Dans cette vidéo, nous démontrons une technique pour faciliter l’internalisation des nanoparticules de sulfure de cuivre (NPs CuS) recouvertes d’acide folique. Les NP CuS fonctionnalisées par l’acide folique ont la capacité de cibler les récepteurs du folate qui sont surexprimés dans de nombreuses cellules cancéreuses de l’ovaire.

Protocole

1. Synthèse et fonctionnalisation des nanoparticules

ATTENTION : Toute la synthèse doit avoir lieu dans une hotte chimique ventilée.

1. Avant la synthèse, filtrer environ 300 mL d’eau désionisée (DI) à travers un filtre stérile de 0,2 μm.
2. Nettoyez une fiole en verre à fond rond de 250 ml avec une solution détergente et rincez-la à l’eau DI. Ajouter 0,0134 g de CuCl₂ dans 100 mL d’eau DI pour créer une solution de 1 mM.
3. Ajouter 0,015 g d’acide folique (FA) à la solution de CuCl₂ et remuer pendant ~5 min à l’aide d’un barreau magnétique.
4. Ajouter Na₂S·9H₂O (0,024 g dans de l’eau DI de 100 μL) pendant environ 10 s au mélange réactionnel à l’aide d’une pipette de 200 μL.
   note: Lors de l’ajout du Na₂S·9H₂O, la solution changera de couleur d’un jaune clair à un brun foncé.
5. Boucher la réaction et placer dans un bain d’huile, réglé à 90 °C, et continuer à agiter avec une barre d’agitation magnétique. Après environ 15 minutes, ou lorsque le bain d’huile a atteint 85-90 °C, laissez la réaction se poursuivre pendant une heure supplémentaire. Votre mélange doit progressivement virer à une couleur vert foncé.
   note: Assurez-vous de ventiler le système pendant qu’il chauffe le mélange réactionnel pour éviter l’accumulation de pression.
6. Retirez la cuve de réaction du bain d’huile et laissez-la refroidir brièvement à température ambiante pendant environ 10 à 15 minutes avant de la transférer dans un bain de glace.
7. Une fois que le mélange réactionnel a refroidi en dessous de 20 °C, ajustez le pH à 10 en utilisant 1M de NaOH pour dissoudre l’acide folique restant dans la solution.
8. Purifier le mélange réactionnel FA-CuS à l’aide d’une colonne de centrifugation de 30 kDa. Ajouter la solution par lots de 15 mL dans la colonne et centrifuger à 3 082 x g pendant 15 min.
9. Une fois que tout le mélange réactionnel a été concentré, recombinez les fractions concentrées et lavez 4 fois avec 15 mL de NaOH pH 10 dans la colonne de centrifugation de 30 kDa.
10. Pour les mesures de masse, prélever 1/3 de la solution (~66 μL) et diviser en trois flacons en verre. Sécher dans un four sous vide pendant une nuit à 40 °C sous vide de ~27 mmHg.
11. Dissoudre les 2/3 restants de la solution concentrée dans 250 μL de PBS et conserver à 4 °C jusqu’à nouvel ordre.
12. Avant d’utiliser les NP FA-CuS, sonicez-les pendant 30 minutes dans un sonicateur de bain à réglage élevé.

2. Absorption des NPs FA-CuS par les cellules cancéreuses de l’ovaire

1. Avant l’incubation avec des nanoparticules FA-CuS, incuber les cellules SKOV-3 dans une fiole T75 contenant 8 à 15 ml de milieu RPMI-1640 exempt d’acide folique avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline/streptomycine pendant au moins 24 h.
2. Ensemencer les cellules dans 0,5 mL de milieu de croissance complet RPMI-1640 sans acide folique à une densité de 0,1 x 10⁶ cellules/mL dans une plaque à 24 puits.
3. Le lendemain, incuber les cellules avec 400 μg/mL de FA-CuS NPS dans 0,5 mL de milieu de croissance complet RPMI-1640 sans acide folique pendant 2 h.
4. Après cette incubation, trypsinisez les cellules avec 0,5 mL de trypsine à 0,25 % avec de l’EDTA. Ajouter au moins 1 mL de milieu de croissance complet RPMI-1640 sans acide folique pour neutraliser la trypsine, et centrifuger les cellules à 123 x g pendant 6 min.
5. Retirez le surnageant, remettez les cellules en suspension dans 2 mL de PBS et centrifugez à 123 x g pendant 6 min. Effectuez cette étape de lavage 2 fois pour éliminer tous les NP non liés.
6. Remettre les cellules en suspension dans 1 à 2 ml de PBS avec une solution de préadolescent à 2 %.
7. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et de Trypan Blue. De plus, diluez les cellules si le nombre de cellules est trop élevé. Diluer les cellules dans du PBS avec 2 % de Tween à la concentration choisie pour la détection.
8. Les cellules sont maintenant prêtes à être analysées par le système PAFC.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,025 % de trypsine avec EDTA	Corning	Référence 25-053-CL
Filtres centrifuges Amicon Ultra-15	Millipore	UFC903024
Filtres centrifuges Amicon Ultra-4	Millipore	UFC803024
Hématocytomètre à lignes claires	Hausser Scientific	1492
Chlorure de cuivre(II)	ACROS ORGANIQUES	206532500
Bain de nettoyage numérique par ultrasons série CPX	Fisherbrand	Modèle CPX3800
Seringues Norm-Ject de 10 mL	HENKE SASS LOUP	4100-X00V0
FBS	Sigma-Aldrich	F2442-500ML
acide folique	Sigma-Aldrich	F7876-10G
Pbs	Alfa Aesar	J62036
Pénicilline Streptomycine	GIBCO	Référence 15140-122
RPMI Midum 1640 (1x) Sans acide folique	Gibco	Référence 27016-021
Cellules SKOV-3	ATCC	HTB-77
Perles d’hydroxyde de sodium	BDH	BDH9292-500G
Sulfure de sodium non hydraté	Sigma-Aldrich	Réf. 431648-50G
Trypan Blue Solution 0,4 %	Amresco	K940-100ML
Filtre à seringue stérile de 0,2 μm	VWR	Référence 28145-477
Alconox	Sigma-Aldrich	242985-1,8 KG	Détergent utilisé pour le nettoyage de la verrerie.
Préadolescent 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML