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Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Préparation de mitochondries à partir de tissus cancéreux de l’ovaire humain
Des échantillons de tissu ovarien, y compris des tissus cancéreux de l’ovaire (n = 7), ont été utilisés pour ce protocole.
- Préparez 250 mL de tampon d’isolement mitochondrial en mélangeant 210 mM de mannitol, 70 mM de saccharose, 100 mM de chlorure de potassium (KCl), 50 mM de Tris-HCl, 1 mM d’acide diamine tétraacétique (EDTA), 0,1 mM d’acide bis(2-aminoéthyl éther)tétraacétique (EGTA), 1 mM d’inhibiteur de protéase de phénylméthanesulfonyle (PMSF), 2 mM d’orthovanadate de sodium (V) et 0,2 % d’albumine sérique bovine (BSA), pH 7,4.
- Placez ~1,5 g de tissus cancéreux de l’ovaire dans une boîte en verre propre.
- Ajouter 2 ml de tampon d’isolement mitochondrial pré-refroidi pour laver légèrement le sang de la surface des tissus 3x.
- À l’aide de ciseaux ophtalmiques propres, émincez complètement le tissu en morceaux d’environ 1 mm 3, puis transférez les tissus hachés dans un tube à centrifuger de 50 ml.
- Ajouter 13,5 mL de tampon d’isolement mitochondrial contenant 0,2 mg/mL de nagarse, puis utiliser un homogénéisateur électrique pour homogénéiser (utiliser une échelle de 2, 10 s 6x, intervalle de 10 s) les tissus hachés (2 min, 4 °C).
- Ajoutez encore 3 ml de tampon d’isolement mitochondrial dans les homogénats de tissus et mélangez-les bien par pipetage.
- Centrifuger l’homogénat de tissu préparé (1 300 x g, 10 min, 4 °C). Retirer la fraction nucléaire brute (c.-à-d. la pastille) et conserver le surnageant.
- Recentrifuger le surnageant (10 000 x g, 10 min, 4 °C). Retirez les microsomes (c’est-à-dire le surnageant) et conservez la pastille.
- Ajouter 2 mL de tampon d’isolement mitochondrial et bien remettre la pastille en suspension par pipetage léger.
- Centrifuger la suspension de granulés (7 000 x g, 10 min, 4 °C). Jetez le surnageant et conservez les mitochondries brutes (c’est-à-dire la cuillère).
- Ajouter 12 mL de milieu à gradient de densité de 25 % (c.-à-d. Nycodenz) pour remettre en suspension les mitochondries brutes extraites.
- Établir un gradient de densité discontinu en remplissant un tube de bas en haut avec 5 mL de 34 %, 8 mL de 30 %, 12 mL de 25 % (contenant les mitochondries brutes de l’étape 1.11), 8 mL de 23 % et 3 mL de milieu à gradient de densité de 20 %, puis le centrifuger (52 000 x g, 90 min, 4 °C).
- À l’aide d’une seringue longue et émoussée, recueillir les mitochondries purifiées à l’interface entre le milieu à gradient de densité de 25 % et de 30 % dans un tube propre.
- Ajoutez un tampon d’isolement mitochondrial dans les mitochondries collectées pour le diluer en un volume triple. Centrifugez (15 000 x g, 20 min, 4 °C) et jetez le surnageant.
- Ajouter 2 mL de tampon d’isolement mitochondrial pour remettre la pastille en suspension et centrifuger (15 000 x g, 20 min, 4 °C). Jetez le surnageant et conservez la pastille.
- Récupérez la pastille finale (c’est-à-dire les mitochondries purifiées) et stockez-la à -20 °C
note: Combinez toutes les mitochondries purifiées du tissu cancéreux de l’ovaire comme échantillon de mitochondries pour l’analyse protéomique quantitative.