Modélisation d’un modèle de cancer de l’endomètre métastatique : une technique pour générer un cancer de l’endomètre avec métastases ganglionnaires dans des modèles de lapin

Résumé

Source : Lauren Philp et al. Un modèle de cancer de l’endomètre orthotopique avec lymphadénopathie rétropéritonéale fabriqué à partir de cellules VX2 multipliées et cultivées in vivo. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo démontre la génération d’un modèle de cancer de l’endomètre chez le lapin en injectant une suspension de cellules VX2 hautement métastatiques dans les cornes utérines suturées du lapin. Cela conduit à la génération d’un cancer primitif de l’endomètre avec métastases ganglionnaires rétropéritonéales.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Création de la lignée cellulaire VX2 in vitro

1. Récoltez la tumeur VX2 du muscle quadriceps du lapin et de la croissance dans le flanc de la souris.
   1. Décongelez les blocs tumoraux VX2 congelés (1 cm x 1 cm), hachez-les sur une plaque de culture à l’aide d’une lame de scalpel et passez-les à travers un filtre de 70 μm en ajoutant de petites quantités de solution saline équilibrée Hanks (HBSS) séquentiellement pour vous assurer que toutes les cellules sont filtrées pour un volume final de 1 ml.
   2. Compter les cellules et les diluer avec une solution saline tamponnée au phosphate à 0,9 % jusqu’à une concentration de 1 x 10⁷/mL et les placer sur de la glace dans un tube stérile.
      note: Des blocs tumoraux ont été obtenus auprès d’un collaborateur de laboratoire à partir de la propagation antérieure de tumeurs VX2 dans les muscles quadriceps du lapin.
   3. Anesthésier une lapine blanche de Nouvelle-Zélande femelle (poids 2,5 à 3,5 kg) avec de l’isoflurane inhalé à 2 à 5 %, retirer la fourrure recouvrant le site d’injection et nettoyer le site d’injection avec une solution de povidone iodée. Injecter 500 μL de la suspension de cellules VX2 préparée (5 x 10⁶ cellules/mL) dans le muscle quadriceps du lapin. Surveillez cliniquement le lapin pour la croissance tumorale à partir du 10e jour.
   4. Euthanasier les lapins après que les tumeurs atteignent 1 à 1,5 cm de diamètre (mesuré à l’extérieur avec des pieds à coulisse) en utilisant une méthode approuvée par un vétérinaire. Confirmez l’euthanasie en vérifiant les signes vitaux, y compris la fréquence cardiaque et la fréquence respiratoire. Exciser la tumeur à l’aide d’instruments stériles après avoir nettoyé la zone avec une solution de bétadine.
   5. Dans une enceinte de sécurité biologique à l’aide d’instruments stériles, coupez la tumeur en petits morceaux (0,2 cm) sur une boîte de culture tissulaire de 10 cm à l’aide d’une lame de scalpel. Faites passer les fragments tumoraux à travers une passoire cellulaire de 70 μm en utilisant 1 mL de HBSS comme décrit à l’étape 1.1.1. Compter les cellules et diluer à l’aide d’une solution saline à 0,9 % pour obtenir 7,5 x 10⁵ cellules dans 200 μL.
   6. Anesthésier des souris gamma mâles NOD SCID (poids 25 g) avec de l’isoflurane à 4 % à 1 L/min et maintenir l’anesthésie avec de l’isoflurane à 2 %. Une fois les souris anesthésiées, injectez 200 μL de la solution de l’étape 1.1.5 dans le tissu sous-cutané du flanc de la souris à l’aide d’une aiguille de calibre 27.
2. Récolte et passage des cellules VX2 in vitro
   1. Surveillez cliniquement la croissance de la xénogreffe deux fois par semaine jusqu’à ce que les tumeurs atteignent 1 cm de diamètre à l’aide d’un pied à coulisse.
   2. Euthanasier des souris en les plaçant dans une chambre de CO₂ ou en effectuant une luxation cervicale après une anesthésie avec un gaz isoflurane à 4 %. Exciser des tumeurs dans des conditions stériles dans une enceinte de sécurité biologique.
   3. Hacher les tumeurs à l'aide d'un scalpel en morceaux de 1 à 2 mm dans une boîte de culture tissulaire de 6 cm contenant 3 ml de milieu de sérum fœtal bovin (FBS) modifié de Dulbecco (DMEM)/Ham ss F12+ à 10 %.
   4. Laissez les fragments de tumeur intacts dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant deux jours jusqu’à ce que les cellules commencent à se développer à partir des morceaux de tumeur. Par la suite, vérifier quotidiennement la confluence cellulaire des plaques cultivées au microscope optique. Lorsque la confluence atteint 70 %, trypsiniser les cellules en ajoutant 1 mL de trypsine à 0,05 % dans le ballon et en les replaçant dans l’incubateur à 37 °C pendant 5 min.
   5. Neutraliser la trypsine avec 6 mL de milieu DMEM/Ham'ss F12 + 10 % FBS, prélever les cellules et centrifuger à 4 °C pendant 5 min à 300 x g. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 3,5 mL de nouveau milieu DMEM/Jambon F12 + 10 % FBS. Grainez des plaques fraîches de 6 cm de collagène I avec 1,6 x 10⁶ cellules par plaque pour atteindre une densité d’ensemencement cellulaire d’environ 50 %.
      REMARQUE : Une densité cellulaire de 50 % fait référence aux cellules occupant 50 % de la surface de la plaque lorsqu’elles sont fixées.
   6. Passage précoce : Répétez le processus ci-dessus (trypsinisation, ensemencement) jusqu’à ce que les cellules aient été passées 5 fois, puis évaluez la pureté de la lignée cellulaire par PCR à l’aide d’un test PCR quantitatif pour distinguer l’ADN génomique du lapin de l’ADN génomique de la souris (voir les étapes 1.3.1-1.3.4).
      note: Après 8 passages, les cellules peuvent être propagées sur des plaques de culture de tissus adhérents réguliers non recouverts de collagène.
   7. Passage, trypsinisation et congélation d’aliquotes de cellules dans DMEM/HAM F12+30 % FBS+10 % DMSO à une concentration de 2 x 10⁶ par flacon. Stockez les cellules dans de l’azote liquide jusqu’à ce qu’elles soient nécessaires pour les expériences.
3. Confirmation de l’origine VX2 des cellules survivantes :
   1. Créez un remède standard à partir d’ADN génomique purifié de souris et de lapin (étapes 1.3.2 et 1.3.3). Utilisez des amorces qui ciblent des séquences spécifiques à l’espèce dans le deuxième cadre de lecture ouvert de l’élément de rétrotransposon LINE-1.
      note: Les séquences d'amorces pour le CRPV E6 sont les suivantes : 5's- GATCCTGGACCCAACCAGTG et 5's-CCTGCCGGTCCCTGATTTAT. Les éléments rétrotransposons LINE-1 ont été utilisés. Les séquences d'amorces pour le lapin LINE-1 sont les suivantes : 5's-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC et 5's-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGTGT Les séquences d'amorces pour la souris LINE-1 sont : 5's-AATGGAAAGCCAACATTCACGTG et 5's-CCTTCCTTGACCAAGGTATCATTG
   2. Pour créer une courbe standard pour le CRPV E6, purifiez le lysat de cellules tumorales VX2 (étape 1.1.1) à l'aide d'un kit commercial suivant le protocole du fabricant. Quantifiez cet ADN à l’aide d’un test commercial. Effectuez 6 dilutions en série de 225 pg/μL à 0,925 pg/μL dans un tampon à faible teneur en EDTA-TE. Pour créer une courbe standard pour l’ADN génomique de souris, diluez 100 μg d’ADN génomique de souris commercial dans un tampon à faible teneur en EDTA-TE en 5 dilutions de 125 pg/μL à 0,0125 pg/μL.
   3. Placez 4 μL de chaque solution diluée des échantillons de l’étape 1.3.2 dans des puits et analysez les échantillons dans un thermocycleur PCR. Utilisez les valeurs Cq de chaque cycle ainsi que les quantités d’ADN par puits pour calculer une courbe standard à l’aide des paramètres de seuil automatique du logiciel du thermocycleur.
   4. Utilisez les procédures qPCR standard pour effectuer une PCR avec 40 cycles de cycle en 2 étapes (98 °C et 60 °C) sur un thermocycleur. Établissez des valeurs seuils et fixez des valeurs delta Ct à >35 pour garantir une contamination minimale des souris dans la lignée cellulaire VX2 du lapin. Le volume total de chaque réaction était de 10 μL, composé de 5 μL de 2x Mastermix, 1 μL d’amorces directes + inverses avec une concentration finale d’amorces en réaction à 250 nM, et 4 μL d’échantillon d’ADN.
      note: Des valeurs seuils sont établies et les valeurs delta Ct sont fixées à >35 pour garantir une contamination minimale de souris dans la lignée cellulaire VX2 de lapin. Le niveau recommandé d’ADN VX2 pour une détection fiable par qPCR est de 1 à 10 pg.

2. Culture cellulaire VX2 et création de suspension cellulaire

1. Décongeler les fioles contenant des cellules VX2 (congelées à l’étape 1.2.7) dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 minute et transférer les cellules dans un tube à centrifuger conique contenant 10 mL de milieu de culture (1:1 DMEM/F-12 + 10 % FBS et 1 % pénicilline-streptomycine). Centrifuger pendant 8 min à 107 x g, jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 9 mL de milieu.
2. Transférez les cellules remises en suspension dans une grande fiole de culture. Incuber les cellules sans les agiter à 37 °C. Vérifiez quotidiennement la confluence des cellules à l’aide de la microscopie optique et changez de milieu de culture tous les trois jours.
3. Création d’une suspension de cellules VX2 cultivées pour injection
   1. Trypsiniser les cellules en ajoutant 3 ml de trypsine à 0,25 % dans le ballon une fois que les cellules ont atteint 80 % de confluence. Placer le ballon dans l’incubateur (37 °C) pendant 5 min. Transférer la solution dans un tube à centrifuger conique et centrifuger pendant 8 min à 107 x g, puis retirer le surnageant.
   2. Lavez les pastilles cellulaires 3 fois avec 9 mL de solution saline tamponnée au phosphate, centrifugez et éliminez le surnageant comme ci-dessus. Comptez les cellules et diluez-les avec une solution saline tamponnée au phosphate à 0,9 % jusqu’à une concentration de 4 x 10⁷ cellules/mL et placez-les dans un tube à centrifuger conique stérile sur de la glace.
4. Création d’une suspension de cellules VX2 multipliée in vivo pour injection
   1. Décongelez les blocs tumoraux VX2 congelés (1 cm x 1 cm), hachez-les sur une plaque de culture à l’aide d’une lame de scalpel et passez-les à travers un filtre de 70 μm comme à l’étape 1.1.1. Ajouter de petites quantités de HBSS séquentiellement pour s’assurer que toutes les cellules sont sollicitées pour un volume final de 1 ml. Compter les cellules et les diluer avec une solution saline tamponnée à 0,9 % de phosphate jusqu’à une concentration de 1 x 10⁷/mL et les placer sur de la glace dans un tube stérile><. note: Des blocs tumoraux ont été obtenus auprès d’un collaborateur de laboratoire à partir de la propagation antérieure de tumeurs VX2 dans les muscles quadriceps du lapin.

3. Établissement du modèle chirurgical

1. Mise en place de l’anesthésie chirurgicale et préparation préopératoire
   1. Prémédiquez des lapines blanches de Nouvelle-Zélande femelles (2,5 à 3,5 kg) 1 h avant l’intervention chirurgicale prévue à l’aide d’injections d’acépromazine (1 mg/kg IM) et de méloxicam (0,2 mg/kg SQ). Anesthésiez une lapine blanche de Nouvelle-Zélande femelle (poids de 2,5 à 3,5 kg) avec de l’isoflurane inhalé à 2 à 5 %, retirez la fourrure qui recouvre le site d’injection et nettoyez le site d’injection avec une solution de povidone iodée.
   2. Intubez les lapins anesthésiés à l’aide d’un masque laryngé (LMA) et fixez-le en place avec du ruban adhésif, en maintenant une anesthésie profonde en titrant la dose d’isoflurane inhalée entre 2 et 5 %. Surveiller régulièrement l’anesthésie chirurgicale tout au long de l’intervention en vérifiant les signes vitaux (fréquence respiratoire, remplissage capillaire, saturation en oxygène si disponible) et en surveillant les signes évocateurs de douleur (mouvement, retrait des stimuli, bruits) ou d’anesthésie légère (mouvement, mastication sur le tube LMA).
      note: Cela devrait être fait par une personne expérimentée dans la surveillance de l’anesthésie chirurgicale.
   3. Placez un cathéter de veine auriculaire de calibre 22 dans la veine dorsale marginale. Administrer la céfazoline (20 mg/kg) par voie intraveineuse 10 minutes avant l’incision cutanée chirurgicale.
   4. Coupez les poils sur le bassin et l’abdomen avant de placer le lapin sur la table d’opération, puis placez les lapins en position dorsale sur la table d’opération. Nettoyez le champ opératoire à l’aide d’une préparation chirurgicale de la peau en 3 étapes (savon à la bétadine, solution de chlorhexidine, solution de bétadine). Drapez le champ opératoire avec des champs de laparotomie après avoir marqué le haut de l’os pubien, en laissant une zone de 5 cm x 5 cm du bas-ventre exposée.
2. Création de l’incision de laparotomie et identification des cornes utérines
   1. Mettez un bonnet chirurgical et un masque facial. Frottez-vous les mains avec de la chlorhexidine ou une solution de gommage chirurgical à la bétadine. En utilisant la technique stérile, mettez une blouse stérile et des gants chirurgicaux stériles.
   2. À l’aide d’un scalpel à 11 lames #, faites une incision de 2,5 cm de long sur 1 cm du crâne de la symphyse pubienne à travers la peau et le tissu sous-cutané de l’abdomen du lapin. Incisez le fascia droit et disséquez les muscles droits latéralement pour exposer le péritoine sous-jacent. Entrez brusquement dans le péritoine après vous être assuré que la surface inférieure est dégagée de l’intestin ou d’autres organes abdominaux.
   3. Localiser les cornes utérines en identifiant la vessie et en balayant un doigt ganté vers le haut, l’arrière et latéralement sur l’apex de la vessie.
      note: Si nécessaire, la vessie pleine peut être vidée à l’aide d’une pression digitale. Une fois localisés, amenez les cornes utérines à travers l’incision abdominale pour qu’elles reposent sur la paroi abdominale.
   4. À l’aide d’une suture résorbable tressée 3-0, effectuez une ligature de suture unique de chaque corne utérine à environ 1,5-2,0 cm distale des cervicales. Placez la suture juste au milieu des artères utérines, qui longent la face latérale de chaque corne. Attachez les sutures bien ajustées pour obstruer les cornes utérines distales (Figure 1).
3. Inoculation myométrique VX2
   1. À l’aide d’une aiguille de calibre 27, injecter 0,5 mL de la suspension de cellules VX2 préalablement préparée à partir de l’étape 2.3.2 (pour le modèle VX2 cultivé) ou 2.4 (pour le modèle VX2 propagé in vivo) dans le myomètre de chaque corne utérine proximale au site de suture (entre le site de suture et le col de l’utérus). Injectez pendant 1 minute et assurez-vous que les cellules ne sont pas injectées dans la cavité utérine sous-jacente. Anesthésisez les animaux à l’aide d’isoflurane inhalé (2 à 5 %) et d’un appareil anesthésique doté d’un circuit de Bain.
   2. Appliquez une pression sur le site d’injection myométrial pendant 30 secondes après l’injection pour minimiser les fuites de cellules. Inspectez les sites d’injection et de suture pour détecter l’hémostase et remettez les cornes utérines dans l’abdomen.
4. Fermeture de l’incision chirurgicale
   1. Fermeture profonde de la paroi abdominale : Identifiez l’apex de l’incision péritonéale et saisissez le péritoine, le muscle droit et le fascia à l’aide d’une pince à tissus.
      1. Pour ce faire, ancrez la suture à un sommet de l’incision en suturant superficiellement à profond d’un côté de l’incision et profond à superficiel de l’autre. Faites un nœud. À l’aide de la suture attachée, faites des points de suture perpendiculaires à l’incision à travers les couches de la paroi abdominale en travaillant par étapes le long de l’incision d’un côté à l’autre. Attachez la suture et coupez.
   2. Fermeture superficielle de la paroi abdominale : Identifiez l’apex de l’incision cutanée et suturez la peau abdominale à l’aide d’une suture sous-cutanée subcuticulaire 3-0 résorbable en polyfilaments. Appliquez de la colle chirurgicale sur l’incision fermée pour vous opposer aux bords de la peau.
      1. Pour ce faire, ancrez la suture à un sommet de l’incision, en suturant profondément à superficiel d’un côté de l’incision et superficiel à profond de l’autre. Faites un nœud. À l’aide des sutures attachées, faites des points de suture dans la couche dermique parallèlement à l’incision en travaillant par étapes le long de l’incision d’un côté à l’autre. Attachez la suture et coupez.
5. Soins postopératoires
   1. Réveil de l’anesthésie : Arrêtez l’isoflurane une fois l’incision fermée et laissez le lapin respirer de l’oxygène à l’aide d’un masque tout en surveillant les signes de réveil (p. ex., mouvements spontanés, ouverture des yeux et mouvements de mastication sur les voies respiratoires du masque laryngé). Extubez le lapin une fois que ces signes sont notés et fournissez de l’oxygène avec un masque et une couverture chaude jusqu’à ce que les lapins soient alertes et capables de s’asseoir indépendamment.
   2. Suivi postopératoire : Surveiller les lapins deux fois par jour pendant 4 jours et tous les jours pendant 10 jours supplémentaires après l’opération. Surveiller, évaluer leur état général, leur consommation de nourriture et d’eau, leur débit urinaire et fécal, l’évaluation de la douleur, leur poids, leurs signes vitaux (fréquence cardiaque, fréquence respiratoire) et leur site opératoire à la recherche d’un gonflement, d’un érythème, d’un écoulement ou d’une déhiscence.
   3. Contrôle de la douleur postopératoire : Administrer du méloxicam quotidiennement (0,2 mg/kg SQ) pendant 48 heures postopératoires, puis au besoin en fonction de l’évaluation de la douleur. Administrer la buprénorphine immédiatement après l’opération et toutes les 12 h (0,01 à 0,05 mg/kg SQ) pendant 24 heures, puis au besoin en fonction de l’évaluation de la douleur
   4. Des antibiotiques (enrofloxacine 5 mg/kg IM) peuvent être administrés quotidiennement pendant sept jours postopératoires pour prévenir l’infection de la plaie, comme recommandé par votre vétérinaire. Administrez des liquides sous-cutanés (15 ml de SQ) deux fois par jour au besoin pour la déshydratation et des aliments mous ou d’autres suppléments alimentaires sont fournis quotidiennement au besoin pour la perte de poids.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Scalpel à 11 lames, stérile, jetable	Aspen Surgical (VWR)	Référence 80094-086
Cathéter veineux auriculaire à 22 gagues	CDMV	Référence 14332
Suture polyfilament résorbable 3-0 (Polysorb)	Covidien	356718
Suture résorbable tressée 3-0 (Polysorb)	Covidien	356718
Crépine à cellules 70uM, emballée individuellement, Nylon	Faucon	Référence 352350
Acépromazine (Atravet)	CDMV	N° 1047
Savon à la bétadine (Poviodone iode 7,5 %)	CDMV	Réf. 4363
Solution de bétadine (Poviodone iode 10 %)	Magasins UHN	457955
Buprénorphine	Université McGill
Céfazoline	Pharmacie pour patients hospitalisés du RUS	Pas besoin de Cat #
Solution de chlorhexidine	CDMV	119872
Corning BioCoatCellware, collagène de type I, plats de 100 mm	Corning	Référence 354450	La marque n’est pas importante
Corning BioCoatCellware, collagène de type I, plaques à 24 puits	Corning	354408	La marque n’est pas importante
Corning BioCoatCellware, collagène de type I, plaques à 6 puits	Corning	Référence 354400	La marque n’est pas importante
Matrice de membrane basale Corning Matrigel, *sans LDEV, 10 mL	Corning	354234
DMEM/HAM F12 1:1	Technologies de la vie	Référence 11320	La marque n’est pas importante
Dmso	Laboratoire de chimie de Caledon	01/10/4100
Enrofloxacine (Baytril injectable)	CDMV	Référence 11242
Tube Faucon	Corning Centri-Star	430828
Sérum fœtal bovin, qualifié, origine canadienne, 500ml	Technologies de la vie	12483020	Marque/source non importante
L’isoflurane	Pharmacie pour patients hospitalisés du RUS	Pas besoin de Cat #
Contraste isohexol	GE Soins de santé	407141210
Méloxicam (Metacam 0,5 %)	CDMV	104674
Sérum physiologique	Marque maison (UofT Medstore)	N° 1011
Pbs	Multicellulaire ou Sigma	331-010-CL ou D8537-500mL
Pénicilline/Streptomycine (100 ml ; pénicilline 10000U, streptomycine 10000ug)	Corning-Cellgro	CA45000-652
Solution saline équilibrée stérile Hanks (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red)	T.C.M.F (Dr Bristow)	28-janv.-11
Colle chirurgicale (adhésif tissulaire)	3M Vetbond	14695B
Trypsine (0,25 %), qualité protéomique	sigma	T-6567-5X20UG
Trypsine-EDTA, 0,05 %, 100 ml	Wisent Inc	325-542-EL	La marque n’est pas importante