Toutes les procédures impliquant des animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Mise en place et incubation de la lame traitée à l’ITO pour les cocultures
- Cocultures indivise
- Liquéfier l’agarose à 70 °C sur une plaque chauffante.
- Placez le séparateur à 8 puits sur la lame traitée au tinoxyde d’indium (ITO) (Figure 1A). Le fond en caoutchouc du séparateur facilite l’adhérence à la glissière, mais assurez-vous d’appliquer une légère pression continue vers le bas pendant le placage d’agarose pour éviter toute fuite ou mélange entre les puits.
- Prélever les cellules dans un tube conique de 15 mL, centrifuger (5 min à 800 tr/min) et remettre en suspension à 50 000 cellules par 150 μL dans 1 milieu DMEM. Si une densité cellulaire différente est optimale, assurez-vous qu’à cette étape, la suspension cellulaire est 2 fois supérieure à la densité finale souhaitée (par exemple, pour une concentration finale de 50 000 cellules dans 300 μL, la densité cellulaire à cette étape est de 50 000 cellules dans 150 μL).
- Avant de plaquer la culture cellulaire, ajoutez l’explant ovarien au centre du puits (Figure 1B).
- Ajouter de l’agarose à chaque culture cellulaire dans des tubes individuels de 2 mL juste avant le placage. Pour chaque puits, combiner 200 μL de suspension cellulaire et 200 μL d’agarose liquéfiée dans un tube de 2 mL. Par exemple, pour quatre puits, combinez 800 μL de suspension cellulaire et 800 μL d’agarose à 2 %. Il restera un peu de mélange, mais en faire un peu plus que nécessaire évite les bulles d’air lors du pipetage.
- Ajoutez de l’agarose aux cultures cellulaires individuelles immédiatement avant de plaquer cette culture cellulaire. L’agarose refroidira en moins d’une minute, alors préparez-vous à servir rapidement.
- Ajouter immédiatement 300 μL du mélange cellule/agarose dans chaque puits (figure 1C). La figure 1C montre trois affections cellulaires et une affection médiale, chacune plaquée avec et sans ovaire.
- Incuber la lame à 37 °C et 5 % de CO₂ dans un incubateur humidifié.
- Cocultures divisées
- Découpez les séparateurs dans du plastique fin et lisse (Figure 2A).
note: Cette expérience utilise les côtés d’un bassin de milieux jetables stériles car ils sont plats et minces. Coupez-les juste assez larges pour qu’ils s’insèrent parfaitement dans l’hypoténuse du puits (~13 mm).
- Liquéfier l’agarose à 70 °C sur une plaque chauffante.
- Placez le séparateur à 8 puits sur la lame traitée à l’ITO (Figure 2B). Le fond en caoutchouc du séparateur facilite l’adhérence à la glissière, mais assurez-vous d’appliquer une légère pression continue vers le bas pendant le placage d’agarose pour éviter toute fuite ou mélange entre les puits.
2. Séchage de la lame et préparation pour MALDI-TOF MS
- Après quatre jours (ou à tout autre moment de votre choix), retirez le séparateur de chambre des bouchons d’agarose et de la lame (figure 1D). Détachez doucement les côtés de l’agarose de la chambre avec une spatule plate et tirez doucement la chambre vers le haut, en faisant attention de ne pas déplacer les bouchons d’agarose. S’ils bougent, repositionnez-les doucement de manière à ce qu’ils ne se touchent pas.
- Placez la lame dans un four à 37 °C pendant environ 4 heures, en la tournant à 90° toutes les heures.
note: La rotation de la lame est importante pour assurer une répartition uniforme de la chaleur dans tout l’échantillon.
- Une fois sèche, retirez la lame du four (Figure 1E).
- Appliquer la solution matricielle à l’aide du pulvérisateur (figure 1F), en respectant les paramètres suivants : température = 30 °C, débit = 0,2 mL/min, nombre de passages = 8, direction = CC et distance entre les buses = 40 mm.
note: Au lieu d’un pulvérisateur matriciel, un aérographe artistique peut être utilisé pour appliquer une matrice liquide. La même solution matricielle peut être utilisée pour la pulvérisation, mais environ deux fois plus de solution est nécessaire. Avec la glissière serrée de manière à ce qu’elle pende verticalement, vaporisez la glissière à un angle de 90° à environ un pied jusqu’à ce que la couche de matrice soit visible.
- Ajoutez 1 μL d’étalon (rouge de phosphore pour les cibles <500 Da), un mélange peptidique (voir le tableau des matériaux) pour les cibles <5 000 Da) pour éliminer les taches sur la lame. Le rouge de phosphore ne nécessite aucun mélange avec la matrice, mais le mélange peptidique nécessite un mélange 1:1 avec la matrice pour faciliter l’ionisation. Attendez que le calibrant sèche.
- Dessinez un X à l’aide d’un marqueur permanent à chaque coin de la diapositive et prenez une image optique à l’aide d’un appareil photo ou d’un scanner à 1 200 ppp.
