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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Synthèse du noyau de nanoétoile d’or
REMARQUE : Les nanoétoiles d’or sont utilisées comme noyaux pour les deux types de nanosondes SERRS utilisées dans cette expérience.
- Préparer 800 mL de solution d’acide ascorbique 60 mM (C6H8O6) dans de l’eau désionisée (DI) et 8 mL de solution d’acide tétrachloroaurique (HAuCl4) à 20 mM dans de l’eau DI. Refroidir à 4 °C.
- Effectuer cette étape de réaction à 4 °C. Placer une fiole conique contenant 800 mL de la solution d’acide ascorbique sur une plaque d’agitation magnétique et induire un vortex régulier. Ajouter rapidement 8 ml de la solution d’acide tétrachloroaurique dans le vortex. En quelques secondes, des nanoétoiles se formeront et la solution prendra une couleur bleu foncé. Si la couleur devient rose ou violette, signifiant la formation de nanosphères, la suspension doit être jetée et la synthèse relancée.
- Verser la suspension nanostar dans des tubes coniques de 50 mL et centrifuger pendant 20 min (4 °C, 3 220 x g). Aspirer le surnageant en laissant environ 200 μL de solution dans chaque tube. Attention à ne pas déranger la pastille de nanoparticules au fond du tube.
note: Le surnageant devrait avoir une teinte bleue à cause des nanoétoiles en suspension restantes.
- À l’aide d’une micropipette, agitez la solution pour suspendre et recueillir les nanoparticules de chaque tube. Une partie de la pastille peut être compactée au fond du tube et ne se remettra pas en suspension même avec un pipetage vigoureux - jetez cette partie.
- Transférez la suspension de nanoparticules dans une cassette de dialyse (MWCO 3,5 kDa) et dialysez au moins trois jours contre 2 L d’eau DI, en changeant l’eau tous les jours. Conservez les nanoétoiles en dialyse à 4 °C pendant un mois maximum, avec des changements d’eau tous les 3-4 jours.
note: Les nanoétoiles doivent être conservées en dialyse jusqu’à ce qu’elles soient nécessaires à la réaction de silication, comme décrit dans la section 2.
2. Formation de la coquille de silice
REMARQUE : Deux saveurs de nanosondes Raman sont synthétisées. Le processus de synthèse est le même pour les deux, la seule différence étant la molécule rapporteure Raman (colorant) utilisée. Dans cette expérience, le perchlorate IR780 et l’IR140 sont utilisés. La réaction doit toujours être effectuée dans des récipients en plastique. La synthèse est hautement évolutive et peut être ajustée pour la quantité souhaitée d’injectat requise. Ici, une synthèse de lots moyens est décrite, qui peut être mise à l’échelle linéairement à des volumes plus bas ou plus élevés selon les besoins, avec les mêmes concentrations et temps de réaction. Les réactions pour les deux types de nanosondes SERRS peuvent être réalisées en parallèle. Faites attention à éviter la contamination croisée. La sonication doit être effectuée pour la redispersion des pastilles de nanoparticules après centrifugation pendant les étapes de lavage ou après que les nanoparticules ont été stockées pendant plus d’une heure. La sonication doit être effectuée jusqu’à ce que les nanoparticules soient clairement suspendues dans la solution, généralement pendant 1 s.
- Dans le tube A (un tube conique de 50 ml), mélangez 10 ml d’isopropanol, 500 μL de TEOS, 200 μL d’eau DI et 60 μL de colorant (perchlorate IR780 ou IR140, 20 mM dans du DMF (diméthylformamide)).
- Dans le tube B (un tube conique de 15 ml), mélangez 3 ml d’éthanol et 200 μL d’hydroxyde d’ammonium. Sonicez les nanoétoiles à partir de l’étape 1.4 pour disperser les amas en solution et ajoutez 1,2 ml de nanoétoiles dans le tube.
REMARQUE : la solution d’hydroxyde d’ammonium est très volatile et difficile à pipeter avec précision. Conservez-le à 4 °C, jusqu’à ce que vous en ayez besoin, pour faciliter le pipetage.
- Placez le tube A sur un mélangeur à vortex et induisez un vortex régulier. Ajoutez rapidement le contenu du tube B dans le vortex et continuez à mélanger pendant environ 5 s. Transférez immédiatement dans un agitateur et laissez-le réagir pendant 15 min tout en secouant à 300 tr/min, à température ambiante.
- Après l’incubation de 15 min, éteindre la réaction en ajoutant de l’éthanol pour remplir le tube de 50 mL. Centrifugeuse pendant 20 min à 3 220 x g et 4 °C.
- Aspirez le surnageant en laissant environ 0,5 mL de solution, en prenant soin de ne pas déranger la pastille. Ajouter 1 mL d’éthanol et agiter avec une pipette pour remettre les nanoparticules en suspension. Transvaser dans un tube à centrifuger de 1,5 mL et laver 4 fois avec de l’éthanol en centrifugeant à 11 000 x g pendant 4 min, en aspirant le surnageant et en remettant la pastille en suspension par ultrasons pendant environ 1 s.
- REMARQUE : À ce stade, les nanoparticules silicatées peuvent être fonctionnalisées, comme décrit dans la section 3, ou remises en suspension dans de l’eau DI avec une étape de lavage supplémentaire, pour un stockage à 4 °C pendant une semaine au maximum.
3. Fonctionnalisation de surface
REMARQUE : Les nanosondes SERRS IR780 seront conjuguées avec des anticorps ciblant le récepteur du folate via un réticulant PEG pour former des NP-FR ; Les nanosondes de contrôle IR140 SERRS seront conjuguées à une monocouche PEG passivante, pour les NT-NPs. Les deux arômes sont formés par une réaction thiol-maléimide dans des réactions distinctes mais parallèles.
- Laver les nanoparticules deux fois en les centrifugant à 11 000 x g pendant 4 min, en aspirant le surnageant et en remettant la pastille en suspension dans 1 mL d’éthanol par ultrasons. Répétez l’étape de lavage une fois de plus, mais redispersez dans 1 ml d’éthanol à 85 %, de 10 % de 3-MPTMS (3-mercaptopropyltrimoxysilane) et d’eau DI à 5 %. Incuber à température ambiante pendant 1 à 2 h pour introduire les thiols à la surface des particules.
- Laver les nanoparticules fonctionnalisées aux thiols en les centrifugant à 11 000 x g pendant 4 min, en aspirant le surnageant et en remettant la pastille en suspension par ultrasons, deux fois dans de l’éthanol, deux fois dans du DI et enfin dans un tampon HEPES (4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinésulfonique) (10 mM, pH 7,1), et réserver.
- REMARQUE : Il faut utiliser un tampon MES (acide 2-(N-morpholino) éthanesulfonique) ou HEPES. Les tampons à salinité plus élevée, tels que le PBS (phosphate-buffered saline), peuvent induire l’agrégation de nanoparticules.
- Pour les αFR-NPs fonctionnalisées par anticorps, faire réagir 200 μg d’anticorps (clone d’anticorps de la protéine de liaison anti-folate [LK26]) avec un excès molaire dix fois plus important de réticulant PEG (poly(éthylène glycol) (N-hydroxysuccinimide 5-pentanoate) éther N′-(3-maleimidopropionyl) aminoéthane (CAS : 851040-94-3), dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO)) dans 500 μL de tampon MES (10 mM, pH 7,1) pendant 30 min.
- Éliminer l’excès de réticulant et concentrer l’anticorps en centrifugeant la solution d’anticorps-PEG dans un filtre centrifuge (MWCO 100 kDa). Pour les filtres centrifuges utilisés dans cette étude, effectuez une centrifugation pendant 10 min à 14 000 x g et 23 °C. Récupérez les anticorps conjugués dans un tube frais en inversant le filtre et en centrifugeant à 1 000 x g pendant 2 min.
- Pipetez les nanoparticules IR780 de l’étape 3.2 dans le tube avec les anticorps et agitez avec la pipette pour mélanger. Incuber le mélange pendant au moins 30 min à température ambiante ou à 4 °C pendant la nuit pour former les αFR-NPs.
- Pour former des NP-nt, ajoutez 1 % p/v de (m)PEG5000-maléimide à terminaison méthoxy (CAS : 99126-64-4) dissoute dans du DMSO aux nanoparticules IR140 SERRS de l’étape 3.2 et laissez réagir dans un tampon MES de 500 μL (10 mM, pH 7,1) pendant au moins 30 min à température ambiante ou à 4 °C pendant la nuit.
- Pour l’administration à des souris (section 4), faire tourner les deux arômes de nanosonde à 11 000 x g pendant 4 min, aspirer le surnageant pour éliminer la solution avec des anticorps libres n’ayant pas réagi/PEG, et redisperser chaque arôme dans un tampon MES (10 mM, pH 7,1) à des concentrations de 600 pM. Lors de la remise en suspension des nanoparticules, minimisez l’exposition inutile aux ultrasons pour éviter la dénaturation de l’anticorps.
4. Injection de nanosonde et imagerie
- Préparer des nanosondes (αFR-NPs et nt-NPs) comme décrit aux sections 1 à 3 et mélanger selon un rapport de 1:1, pour une concentration finale de 300 pM de chaque type dans un tampon MES (10 mM, pH 7,1). En option, préparez des étalons de référence de 30 pM de chacun des arômes de nanosonde dans de petits tubes coniques (100 μL).
- Injectez par voie intrapéritonéale 1 mL de suspension de nanoparticules dans chaque souris et massez doucement le ventre pour répartir les nanoparticules dans la cavité péritonéale. Remettez la souris dans son logement. Après 25 minutes ou plus, euthanasiez la souris par asphyxie au CO2.
- Fixez la souris sur une plate-forme chirurgicale, en position couchée (pour l’imagerie de l’abdomen entier, la plate-forme doit pouvoir être montée sur la platine du microscope vertical).
- À l’aide d’une pince dentelée et de ciseaux de dissection, retirez la peau pour exposer le péritoine et effectuez une grande incision sagittale (entre 2 et 3 cm de longueur) pour exposer tout l’abdomen. Fixez les rabats péritonéaux sur la plate-forme. Lavez l’intérieur de la cavité péritonéale avec au moins 60 ml de PBS à l’aide d’un flacon pulvérisateur en plastique.
REMARQUE : Pour permettre une imagerie sans obstruction de l’ensemble de l’abdomen, les intestins doivent être mobilisés ou excisés. Pour l’excision, réséquez avec une ligature des vaisseaux mésentériques afin de réduire l’hémorragie dans la cavité abdominale.
- Alternativement, pour imager des organes spécifiques, excisez-les après le lavage PBS et placez-les sur une lame de microscope.
- Transférez la plate-forme ou la diapositive sur un microspectrophotomètre Raman avec une configuration optique verticale et une platine motorisée pour l’imagerie ; utilisez un système commercial avec un laser à diode de 300 mW 785 nm, avec un réseau de 1 200 rainures par mm, centré à 1 115 cm-1.
- Concentrez-vous sur la zone d’intérêt à l’aide de l’optique de la lumière blanche, parfocale avec le laser Raman. Sélectionnez la zone à imager et la résolution souhaitée ; Dans ce rapport, un mode d’acquisition à grande vitesse a été utilisé (spectres acquis sous éclairage laser continu avec la platine du microscope en mouvement constant, avec une résolution spatiale effective de 14,2 μm sur 200 μm ; à un grossissement de 5x, une puissance de 100 mW à l’objectif et une exposition de <100 ms par point).
note: Les tubes avec les nanosondes de référence de l’étape 4.1 peuvent être placés dans la zone imagée si nécessaire, afin de fournir des étalons de référence internes pour l’analyse ultérieure. Assurez-vous qu’aucune source de lumière étrangère autre que le laser n’atteint l’objectif.
- Si vous le souhaitez, préparer l’échantillon pour le traitement histologique et la validation par fixation dans du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant une nuit à 4 °C. Rincer avec du PBS à 4 °C pendant 15 minutes au moins deux fois. Conserver l’échantillon dans de l’éthanol à 70 % dans l’eau jusqu’au traitement histologique standard et à l’enrobage de paraffine. Pour la validation histologique des tumeurs, des coupes (5 μm d’épaisseur) provenant de différentes profondeurs du bloc de paraffine peuvent être colorées avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E).