Système de culture proximale : une technique de culture in vitro pour étudier la signalisation paracrine entre les cellules

Résumé

Source : Dasari, S. et al. Une méthode de culture proximale pour étudier la signalisation paracrine entre les cellules.J. Vis. Exp. (2018)

Dans cette vidéo, nous développons un modèle de co-culture proximale de cellules cancéreuses de l’ovaire et de cellules mésothéliales humaines primaires. Ce modèle physiologiquement pertinent permet l’étude de la signalisation paracrine, où les concentrations localisées des facteurs sécrétés sont maintenues tout en empêchant le contact cellulaire direct.

Protocole

A. Préparation cellulaire

1. Isolement et culture de cellules mésothéliales primaires humaines
   1. Isolez les cellules mésothéliales primaires humaines (HPMC) de l'épiploon humain et cultivez-les dans un milieu de croissance complet [milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % de pénicilline-streptomycine, 1 % d'acides aminés non essentiels et 1 % de vitamines] à 37 °C et 5 % de CO₂,
      note: Les HPMC sont généralement cultivés à 100 % de confluence (Figure 1A).
2. Conditions de croissance des cellules cancéreuses de l’ovaire
   1. Cultivez des cellules cancéreuses de l’ovaire HeyA8 dans un milieu de croissance complet à 37 °C et 5 % CO₂.
      note: Utilisez des cellules HeyA8 cultivées à environ 80 % de confluence (Figure 1B).

B. Culture cellulaire

1. Installation de culture proximale
   1. Utilisez des inserts Transwell pour des plaques à 6 puits avec une membrane en polycarbonate traitée pour culture tissulaire de 10 μm d’épaisseur avec des pores de 0,4 μm (10⁸ pores/cm²) et une zone de croissance de 4,67 cm². Si nécessaire, optimisez les différentes tailles d’inserts en échelonnant le nombre de cellules ensemencées en fonction de la surface de croissance. Réchauffez le milieu de croissance complet, la trypsine et la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 37 °C avant utilisation.
2. Préparation des inserts
   1. Pour ensemencer les cellules HeyA8 sur la face inférieure de la membrane de l’insert, retirez l’insert de son emballage à l’aide d’une pince stérile et placez-le inversé dans une boîte de culture stérile de 15 cm.
   2. Utilisez un plat de 15 cm, car il a la profondeur nécessaire pour accueillir l’insert inversé, ou remplacez-le par tout récipient stérile approprié. En fonction de l’expérience, placez le nombre requis d’inserts dans le plat de 15 cm.
   3. Étiquetez les trois commandes et les trois conditions expérimentales en conséquence avec un marqueur sur le bord des inserts.
3. Préparation des cellules cancéreuses
   1. Pour trypsiniser les cellules HeyA8 cultivées à 80 % de confluence dans une fiole de^{25 cm (}~2 x 10⁶ cellules), ajoutez 1 mL de trypsine (0,25 %) pendant 40 à 60 s et neutralisez la trypsine avec 6 mL de milieu de croissance complet.
   2. Centrifuger les cellules à 500 x g à température ambiante (RT) pendant 3 min, jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 5 mL de milieu de croissance complet. Comptez les cellules vivantes à l’aide de la méthode d’exclusion du colorant bleu trypan.
4. Ensemencement des cellules cancéreuses
   1. Mettre en suspension 100 000 cellules/ml de cellules HeyA8 vivantes dans un milieu de croissance complet. Ensemencez soigneusement 80 000 cellules HeyA8 en suspension dans 800 μL de milieu de croissance complet au bas de l’insert (qui est maintenant orienté vers le haut, puisqu’il est inversé).
   2. Ensemencez les cellules pour qu’elles forment une forme de dôme afin qu’elles restent sur l’insert (figure 1C). Commencez par le centre de la membrane et déplacez-vous vers l’extérieur en cercles concentriques tout en pipetant lentement. Évitez de vous éloigner de plus de 3 mm du bord pour éviter tout déversement du support.
      note: Le nombre de cellules ensemencées dépendra du taux de croissance des cellules et de la durée de l’expérience. Le nombre de cellules HeyA8 ensemencées pour cette culture proximale a été optimisé, et les cellules seront confluentes à 80-90 % à la fin du troisième jour.
5. Attachement des cellules cancéreuses
   1. Couvrez le plat de 15 cm et déplacez avec précaution le plat contenant les inserts dans l’incubateur de CO₂. Il est essentiel de ne pas perturber la chute du milieu et des cellules sur l’insert à cette étape. Laissez les cellules à 37 °C pendant 4 h pour permettre aux cellules cancéreuses de se fixer à l’insert.
6. Préparation des cellules mésothéliales
   1. Après environ 4 h, trypsiniser les HPMC cultivés à 100 % de confluence dans une fiole de⁷⁵ cm (~4 x 10⁶ cellules) avec 2 mL de trypsine (0,25 %) pendant 1 à 2 min et neutraliser la trypsine avec 12 mL de milieu de croissance complet.
   2. Centrifuger les cellules à 500 x g à RT pendant 3 min, remettre la pastille cellulaire en suspension dans 10 mL de milieu de croissance complet et compter les cellules vivantes à l’aide de la méthode d’exclusion du colorant bleu de trypan.
7. Ensemencement des cellules mésothéliales
   1. Mettre en suspension 300 000 cellules/ml de HPMC vivants dans un milieu de croissance complet. Ajouter 2,5 mL de milieu de croissance complet frais dans chaque puits d’une plaque à 6 puits. Sortez avec précaution le plat de 15 cm contenant les inserts vers le capot de biosécurité. À l’aide d’une pince stérile, retournez l’insert et placez-le dans le puits de la plaque à 6 puits de manière à ce qu’il soit vertical, avec les cellules HeyA8 fixées à la surface inférieure immergées dans le milieu de croissance complet (Figure 1C).
   2. Implantez 450 000 HPMC en suspension dans 1,5 mL de milieu de croissance à l’intérieur des inserts avec les cellules HeyA8 fixées à la surface faisant face au fond du puits (figure 1C) ou à des inserts sans cellules HeyA8 pour les témoins HPMC. Ajoutez 1,5 mL de milieu de croissance sans cellules aux témoins HeyA8.
8. Croissance de la culture proximale
   1. Laissez la culture proximale croître dans l’incubateur de CO₂ à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 72 h. Si nécessaire, le milieu peut être réapprovisionné comme suit.
      1. Pour l’intérieur de l’insert, retirer 750 μL et ajouter 750 μL de milieu de croissance complet frais.
      2. Pour l’extérieur de l’insert (la plaque à 6 puits), retirer 1 mL et ajouter 1 mL de milieu de croissance complet frais. Le 1 mL a été choisi pour la commodité de changer de support en une seule étape. Si vous le souhaitez, 1,25 ml peut être retiré et remplacé à la place.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Support perméable Transwell de 24 mm avec insert de membrane en polycarbonate à pores de 0,4 μm	Corning (Costar)	Référence 3412	• Membrane en polycarbonate translucide de 10 μm d’épaisseur. • Traité pour une fixation optimale des cellules. • Emballé 6 inserts dans une plaque de 6 puits, 4 plaques par caisse. • La membrane doit être colorée pour la visibilité cellulaire. • Stérilisé par rayonnement gamma.
Plaque à 6 puits	Corning (Faucon)	353046	Fond plat, traité TC, stérile, avec couvercle
Boîte de culture de 15 cm	Corning (Faucon)	353025	Boîte de culture cellulaire stérile traitée TC
DMEM	Corning (Cellgro)	10-013-CV
Pénicilline Streptomycine	Corning	30-002-CI
MEM Acides aminés non essentiels	Corning (Cellgro)	Référence 25-025-CI
Pipettes			N’importe quelle marque convient
Incubateur à CO2			N’importe quelle marque convient
Armoire de biosécurité de niveau II			N’importe quelle marque convient