Modélisation des métastases du cancer de l’ovaire dans la muqueuse de la cavité péritonéale : une méthode pour établir un modèle 3D in vitro de la muqueuse péritonéale

Résumé

Source : Peters, P. N. et al. Modélisation des premières étapes de la dissémination du cancer de l’ovaire dans une culture organotypique de la cavité péritonéale humaine. J. Vis. Exp. (2015)

Dans cette vidéo, nous montrons le développement d’un modèle tridimensionnel in vitro de la muqueuse de la cavité péritonéale. Cette culture organotypique peut aider à étudier l’adhésion, l’invasion et la prolifération des cellules cancéreuses de l’ovaire.

Protocole

1. Placage de la culture organotypique

1. Libérer les fibroblastes mentonaux normaux (NOF) d’une fiole de culture de^{75 cm 2} en rinçant avec 10 ml de PBS suivi de 3 ml de trypsine à 0,25 % / 25 mM d’EDTA pendant pas plus de 5 min. Neutraliser la trypsine avec au moins 3 fois le volume du milieu de croissance complet.
2. Transvaser les cellules trypsinisées dans un tube conique de 50 ml et les faire tourner à 0,5 g x 3 min. Retirer le surnageant et remonter les cellules dans 5 ml de milieu de croissance complet. À l’aide d’un compteur de cellules, comptez les cellules récupérées dans la fiole de culture.
3. Diluer les cellules dans le volume approprié de milieu de croissance complet jusqu’à ce qu’elles contiennent une plaque de 2 000 à 4 000 NOF par 100 μl sur une plaque noire à fond transparent à 96 puits. Ajoutez 0,5 μg/100 μl de collagène I de queue de rat au mélange cellulaire avant le placage. Laissez les cellules reposer à 37 °C dans 5 % de CO₂ dans un environnement humidifié pendant au moins 4 h, ou jusqu’à ce que les cellules adhèrent à la surface de la plaque.
4. Libérer les cellules mésothéliales humaines primaires (HPMC) du ballon de culture en utilisant les mêmes méthodes que celles décrites aux étapes 1.1 et 1.2. Diluez les cellules dans la quantité appropriée de milieu de croissance complet pour obtenir une plaque de 10 000 à 20 000 HPMC par 50 μl sur le NOF déjà recouvert de collagène I dans des plaques à 96 puits. Laissez les cellules reposer à 37 °C dans 5 % de CO₂ dans un environnement humidifié pendant au moins 18 h avant de commencer les expériences.
5. Cultivez des cellules cancéreuses de l’ovaire HeyA8 exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) dans un milieu de croissance complet. Les cellules cancéreuses de l’ovaire HeyA8 sont marquées par fluorescence par l’expression d’un vecteur lentiviral exprimant le copépode cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). Les cellules cancéreuses de l’ovaire HeyA8 doivent être confluentes à 80-90 % le jour de l’utilisation (phase de croissance logarithmique). Retirer les cellules de la plaque de culture et les compter en utilisant les mêmes méthodes que celles décrites aux étapes 1.1 et 1.2 pour les cellules primaires.
6. Laisser les cellules cancéreuses de l’ovaire se rétablir dans un milieu de croissance complet pendant 15 à 20 minutes à 37 °C dans un tube conique avec le couvercle mal fermé.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pbs	Fisher Scientific	SH3001304
Boîtes de culture de 15 cm	BD Biosciences	353025
DMEM avec L-Glutamine	Corning	10-013-CV
Vitamines MEM	Corning	Référence 25-020-CL
MEM Acides aminés non essentiels	Corning	Référence 25-025-CI
Pénicilline-streptomycine	Corning	30-002-CI
secoueur	Thermo-Fisher	MaxQ 4450
centrifugeuse	Eppendorf	Référence 5702
incubateur	Thermo-Fisher	Forma série II à chemise d’eau Incubateur CO2 modèle 3100
Trypsine EDTA, 1x (0,25 %)	Corning	Référence 25-053-CI
Flacons T-75	BD Biosciences	353136
Flacons T-175	BD Biosciences	353112
Pointes de pipette	Rainin	P2, P10, P20, P200 et P1000
Pointes de pipette	Corning	Pointes filtrées P2, P10, P20, P200 et P1000
Compteur de cellules	Invitrogen	comtesse
Chambre de comptage cellulaire Comtesse Diapositives	Invitrogen	Réf. C10313
Teinture bleue trypan (0,4 %)	Gibco	Référence 15250-061
Collagène de type I (queue de rat)	BD Biosciences	354236
Plaque à 96 puits, fond transparent, noir	BD Biosciences	353219