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Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Isolement et culture de cellules stromales primaires non transformées
- Prélèvement et préparation de tissus humains.
- Prélever des échantillons d’épiploon humain de 2 cm3 lors d’une chirurgie abdominale et immerger immédiatement les tissus dans une solution saline tamponnée au phosphate RT (PBS) (Figure 1A). Un morceau d’épiploon de 3 cm x 2 cm produit généralement 1 million de cellules mésothéliales humaines primaires (HPMC) et 200 000 fibroblastes humains primaires ou fibroblastes mentaux normaux (NOF).
- Faites tourner le PBS dans lequel le tissu a été immergé à 0,5 x g pendant 3 minutes dès que possible après le prélèvement (< 2 heures dans le PBS) et transférez le tissu dans du PBS frais de 20 ml dans un tube conique de 50 ml. Coupez le tissu en morceaux de 5 mm3 en le hachant à l’aide de scalpels dans une boîte de culture stérile de 15 cm de diamètre (figure 1B).
- Isolement de cellules mésothéliales humaines primaires
- Pour isoler le HPMC, transférez le tissu haché dans des tubes coniques de 50 ml et attendez 1 min que les morceaux solides flottent vers le haut (figures 1C et D). Le HPMC et les globules rouges (GR) seront présents dans le liquide au fond. À l’aide d’une pipette, retirez le liquide du fond du tube et le placez dans un nouveau tube conique. Faites tourner le liquide à 0,5 x g pendant 3 min et aspirez le surnageant de la pastille HPMC/RBC.
- Répétez le processus trois fois : ajoutez 20 ml de PBS dans le tissu haché, laissez le tissu lever, retirez le liquide du fond avec une pipette et dans le tube HPMC/RB, tournez vers le bas et retirez le surnageant. Une fois que tous les tours sont terminés et que le surnageant est aspiré, la pastille contiendra du HPMC et du RBC.
- Déposer toutes les cellules de la pastille dans une fiole de 75 cm2 dans 15 ml de milieu de croissance complet (DMEM avec 10 % de sérum de veau fœtal [FBS], 1 % de vitamines MEM [93 mg/L], 1 % d’acides aminés non essentiels MEM [81,4 mg/L], 1 % de pénicilline streptomycine [Pen-Strep, 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine]).
- Effectuez un lavage secondaire du PBS pour isoler les HPMC supplémentaires.
- Pour le lavage secondaire du PBS, agitez le reste du tissu solide à 200 tr/min, 37 °C pendant 10 min dans 20 ml de PBS, puis attendez 1 min que le tissu flotte vers le haut. Retirez le liquide du fond du tube dans un nouveau tube, centrifugez à 0,5 x g pendant 3 min et aspirez le surnageant.
- Déposer tous les HPMC/RBC du lavage secondaire du PBS dans une fiole séparée de75 cm et 2 dans 15 ml de milieu de croissance complet.
- Pour isoler tout HPMC restant, agiter le tissu haché à 200 tr/min, 37 °C degrés pendant 10 min dans 20 ml d’une solution 1:1 0,25 % trypsine 25 mM EDTA :PBS en volume. Laissez le tissu lever, recueillez le liquide au fond du tube dans un nouveau tube de 50 ml et tournez à 0,5 x g pendant 3 min.
- Aspirer le surnageant et mettre en boîte tous les HPMC/GR dans une fiole séparée de75 cm et 2 dans 15 ml de milieu de croissance complet.
- Cultivez les cellules plaquées à 37°C et 5 % de CO2 dans un environnement humidifié. Nourrir les cellules en plaques en ajoutant 15 ml de milieu de croissance complet les jours 3 et 5 sans retirer le milieu usé. Le HPMC peut être cultivé pendant 5 à 7 jours avant de se fendre.
- Utiliser un HPMC à passage bas (jusqu’au passage 2) dans toutes les expériences afin de minimiser la dédifférenciation et la modification du phénotype d’origine. Utilisez un microscope à grand champ, de préférence avec un objectif 20x avec des capacités de contraste interférentiel différentiel en plastique ou un objectif 4-20x avec des capacités de contraste de phase (filtres à contraste de phase au microscope) pour prendre toutes les images des cellules, et un objectif 10x ()en fond clair pour analyser la coloration immunohistochimique 3,3'-Diaminobenzidine (DAB).
- Confirmer que les HPMC sont cuboïdes et exprimer la cytokératine 8 et la vimentine en effectuant une immunohistochimie (Figure 2A, C, E).