Modélisation de la colonisation de l’épiploon par des cellules cancéreuses de l’ovaire : une méthode ex vivo pour établir la colonisation par tache laiteuse de cellules cancéreuses de l’ovaire marquées par fluorescence dans des explants d’épiploon murin

Résumé

Source : Krishnan, V. et al. Approches in vivo et ex vivo pour étudier la colonisation métastatique du cancer de l’ovaire des structures de taches laiteuses dans le tissu adipeux péritonéal. J. Vis. Exp. (2015)

Dans cette vidéo, nous établissons une culture d’organe omental ex vivo superposée à des cellules cancéreuses de l’ovaire exprimant la GFP pour étudier la colonisation du cancer de l’ovaire au sein de l’explant omental. Ce protocole analyse les structures cellulaires immunitaires de l’épiploon appelées taches laiteuses qui favorisent les métastases.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Colonisation de taches laiteuses ex vivo

1. Mise en place des conditions de base de la culture d’organes ex vivo
   1. Placez chaque épiploon dans un seul insert de plaque de culture et placez-le dans un puits d’une plaque de culture tissulaire à 12 puits contenant 500 μl de milieu DME/F12 contenant 20 % de FCS. Maintenir les cultures d’organes à 37 °C dans un environnement à 5 % de CO₂ pendant 24 à 48 heures et/ou à des moments supplémentaires. Utilisez trois mentons indépendants (échantillons en trois exemplaires) pour chaque condition (p. ex., type de milieu/point temporel).
   2. Pour confirmer l’intégrité des tissus aux paramètres expérimentaux, fixer et traiter les échantillons comme décrit à l’étape 1.1.3. Le comptage des adipocytes sains par rapport aux adipocytes nécrotiques sur les coupes H&E permet d’évaluer l’intégrité des tissus. Un minimum de ~120 cellules provenant de cinq échantillons biologiques est nécessaire pour formuler un pourcentage de tissu vivant présent.
   3. Pour mesurer la fonction tissulaire, placez l’épimenta (n = 3) dans des puits séparés d’une plaque à 24 puits contenant 500 μl de milieu DME/F12 avec 20 % de FCS. Laisser l’omenta conditionner le milieu à 37 °C dans un environnement à 5 % de CO₂ pendant 24 heures, puis prélever 250 μl pour l’utiliser dans un test ELISA IL-6.
2. Co-culture ex vivo de l’épiploon de souris avec des cellules SKOV3ip.1-GFP
   1. Cultivez et préparez des cellules marquées par fluorescence en pipetant 1x10⁶ cellules décongelées dans 10 ml de milieu dans une fiole T-75. Laissez les cellules se développer à 37 °C dans un environnement à 5 % de CO₂ jusqu’à ce qu’elles atteignent 70 % de confluence. Trypsiniser et remettre en suspension à une concentration de 2 x 10⁶ cellules par ml.
   2. Appliquez ~6 μl de colle tissulaire sur la membrane de l’insert de culture et laissez-le sécher à l’air. Lavez la membrane deux fois avec de l’eau stérile pour enlever tout excès d’adhésif. Faites sécher les membranes à l’air libre sous un capot laminaire.
   3. Excise soigneusement l’épimenton et fixe-le à la membrane enduite d’adhésif à l’aide d’une pince stérile. Laissez le tissu adhérer à la membrane pendant 1 minute avant d’ajouter le milieu. Ajouter 500 μl de suspension cellulaire sur chaque épiploon dans chaque insert de culture. Remplissez la zone autour de la chambre de transpuits avec 2,5 ml de DME/F-12.
   4. Incuber l’omenta avec une suspension cellulaire pendant 6 heures à 37 °C dans un environnement à 5 % de CO₂. Retirez soigneusement et lavez l’omenta avec ~10 ml de PBS. Visualisez les foyers des cellules cancéreuses fluorescentes à l’aide d’un système d’imagerie fluorescente approprié.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Outils de dissection	Outils scientifiques fins	Na
Geimsa	Fluka/Sigma Aldrich	Référence 48900
5 % de formol	sigma	HT501320
DMEM	Corning	10-013-CV
Pbs	Corning	Référence 21-040-CV	Sans calcium ni magnésium
Collagènase	Worthington	LS004196
Insert de plaque de culture millicellulaire	Millipore	PICM01250
Cell-Tak	Corning	Référence 354240