$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Traitement des tissus
- Dans des conditions stériles, transvaser les échantillons dans une boîte de Pétri (60 mm x 60 mm) contenant 10 ml de PBS frais et glacé et à l’aide d’une lame de rasoir stérile, puis couper en petits morceaux (2 mm ou moins) (figures 1A et 1B).
- Transvaser les tissus hachés dans un tube conique de 15 ml contenant 10 ml de dispase II (2,4 U/ml) préchauffé (37 °C pendant 30 min) dans du DMEM et incuber à 5 % de CO2 et 37 °C pendant 30 min. Pour assurer une digestion optimale des échantillons, agitez manuellement la suspension cellulaire toutes les 5 min.
- Après 30 min d’incubation, transférez (à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml) la suspension cellulaire dans une crépine cellulaire (maille de 70 μm) placée sur un tube conique de 50 ml et appliquez une légère pression contre la maille à l’aide d’un piston de seringue. Jetez tout tissu non dissocié (restant sur le dessus du maillage) et prélevez la suspension cellulaire obtenue dans le tube conique stérile de 50 ml. Centrifuger à 320 x g pendant 7 min à 4 °C (Figure 2).
- Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 ml de DMEM contenant 10 % de FBS.
- Incuber la suspension cellulaire dans une boîte de Pétri à 5 % de CO2 et 37 °C (Figure 3).
- Changez le milieu après 24 heures à partir du placage initial. Cela permet d’éliminer les débris cellulaires et la majorité des érythrocytes présents dans la culture.
- Changez le milieu tous les trois jours pendant les deux semaines suivantes, après quoi les cultures de COE primaire sont prêtes pour les applications en aval.