Dosage de la clairance mésothéliale : une technique in vitro pour quantifier la capacité d’invasion des sphéroïdes du cancer de l’ovaire dans les monocouches de cellules mésothéliales

Résumé

Source : Davidowitz, R. A. et al. Cette vidéo décrit une technique permettant de mesurer quantitativement l’interaction des sphéroïdes du cancer de l’ovaire avec les cellules mésothéliales, à l’aide de cellules marquées par fluorescence et d’une microscopie vidéo en accéléré. Cet essai in vitro modélise l’interaction entre les sphéroïdes des cellules cancéreuses de l’ovaire métastasantes et les cellules mésothéliales tapissant la cavité péritonéale in vivo.

Protocole

1. Formation des sphéroïdes des cellules cancéreuses de l’ovaire

1. Les cellules cancéreuses de l’ovaire exprimant la RFP sont cultivées dans un milieu de base à 10 % (un milieu de culture cellulaire personnalisé contenant un mélange 50:50 de 199 et de MCDB105, 10 % de sérum fœtal bovin inactivé et 1 % de penstreptocoque). Pour exprimer la RFP dans des cellules cancéreuses de l’ovaire non marquées, transfectez les cellules avec un plasmide contenant RFP et sélectionnez les cellules exprimant la RFP. Alternativement, les vecteurs viraux peuvent être utilisés pour exprimer transitoirement des protéines fluorescentes, ou les cellules peuvent être pré-incubées avec un colorant de suivi de cellules fluorescentes rouges (Invitrogen).
2. Avant de former des sphéroïdes du cancer de l’ovaire, il est nécessaire de préparer des boîtes de culture à fond rond à 96 puits à faible adhérence. Pour produire des plaques de culture à faible adhérence, ajoutez 30 μL de solution de poly-HEMA (6 mg de polyhydroxyéthylméthacrylate dans 1 ml d’EtOH à 95 %) dans chaque puits d’une boîte de culture cellulaire à 96 puits. Les plaques de 96 puits sont incubées dans un incubateur non humidifié à 37 °C pour évaporer l’éthanol, laissant un film de poly-HEMA sur chaque puits. Ce film poly-HEMA empêche les cellules de se fixer au fond du puits, forçant les cellules à se développer en suspension. [Alternativement, des plaques de culture à très faible attachement (Corning) peuvent être utilisées.]
3. Ensuite, essayez de tester les cellules cancéreuses de l’ovaire, granulez les cellules dans une centrifugeuse de table (Heraeus) à 900 RCF pendant 3 minutes. Aspirez le surnageant et mettez-le en suspension dans du milieu de base à 10 %.
4. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
5. Ajustez la concentration des cellules de manière à ce qu’il y ait 100 cellules par 50 μL de milieu de base à 10 %.
6. Ajouter 50 μL de suspension cellulaire diluée uniformément suspendue dans chaque puits de la boîte de culture recouverte de poly-HEMA à 96 puits.
7. Incuber la plaque à 96 puits dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C pendant 16 heures (ce temps doit être augmenté ou diminué en fonction du temps nécessaire à une lignée cellulaire particulière pour former des sphéroïdes multicellulaires ou des conditions expérimentales souhaitées) pour permettre aux cellules cancéreuses de l’ovaire de se regrouper, formant un seul sphéroïde multicellulaire dans chaque puits. Certaines cellules tumorales peuvent subir une apoptose pendant cette période, il est donc essentiel de choisir un moment avant l’induction de l’apoptose.

2. Formation de la monocouche de cellules mésothéliales

1. Dans une hotte de culture cellulaire, pré-enduire les puits d’une boîte MatTek à fond de verre à 6 puits de fibronectine en ajoutant 2 ml d’une solution de PBS de 5 μg de fibronectine/ml dans chaque puits de la boîte et en incubant à température ambiante pendant 30 minutes. La qualité optique des fonds en verre des antennes MatTek permet une imagerie microscopique à haute résolution.
Les
2. cellules mésothéliales exprimant la GFP sont cultivées dans un milieu de base à 10 %. Trypsinisez une plaque de cellules mésothéliales, faites-la tourner dans une centrifugeuse de table (Heraeus) à 900 tr/min pendant 3 minutes, aspirez le surnageant et mettez-le en suspension dans 10 % de milieu de base. Les cellules mésothéliales utilisées ici exprimaient déjà la GFP lorsqu’elles ont été obtenues, mais des cellules mésothéliales non marquées peuvent être produites par transfection avec un plasmide contenant de l’ADNc GFP ou par pré-incubation des cellules dans un colorant de suivi de cellules fluorescent vert (Invitrogen).
3. Après l’incubation de 30 minutes de fibronectine (à l’étape 2.1), lavez les puits de la parabole MatTek avec 2 ml de PBS.
4. Aspirez le PBS et la plaque 6 x10⁵ cellules mésothéliales par puits dans chaque puits de la boîte MatTek à 6 puits. Incuber la boîte MatTek dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C pendant la nuit pour permettre aux cellules mésothéliales de se fixer à la boîte et de former une monocouche.

3. Essai de clairance des cellules mésothéliales

1. À l’aide d’une pipette, prélevez les sphéroïdes du cancer de l’ovaire à partir de la plaque recouverte de poly-HEMA à 96 puits.
2. Aspirez le milieu d’un puits de la boîte MatTek à 6 puits contenant une monocouche de cellules mésothéliales. Laver une fois avec 2 ml de PBS. Ajoutez tous les sphéroïdes de la plaque à 96 puits à un puits de la parabole MatTek (~3 fois le nombre de sphéroïdes qui vont être imagés pour tenir compte des sphéroïdes atterrissant sur la partie de la parabole qui ne peut pas être imagée).
3. Placez l’antenne MatTek sur la platine d’un microscope à fluorescence à champ large inversé capable d’effectuer une imagerie en accéléré pendant une durée d’au moins 8 heures. Utilisez une platine motorisée pour imager plusieurs positions dans la parabole, avec plusieurs événements d’intercalation sphéroïde, en une seule expérience. Nous utilisons un microscope time-lapse à fluorescence large champ motorisé inversé Nikon Ti-E avec système de mise au point parfaite intégré et optique à faible grossissement [20x-0,75 ouverture numérique (NA)]/contraste interférentiel différentiel (DIC), un transilluminateur halogène Nikon avec condensateur à longue distance de travail (LWD) de 0,52 NA, des filtres d’excitation et d’émission rapides Nikon (temps de commutation de <100 millisecondes) (GFP Ex 480/40, Em 525/50, RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), des obturateurs intelligents à transmission rapide et à chemin lumineux d’épifluorescence Sutter, une platine motorisée à codage linéaire Nikon, une caméra CCD refroidie Hamamatsu ORCA-AG, une chambre d’incubation de microscope sur mesure avec contrôle de la température et du CO₂, le logiciel Nikon NIS-Elements AR version 3 et une table d’isolation des vibrations TMC.
4. Les sphéroïdes des cellules cancéreuses de l’ovaire se déposeront au fond de la boîte et se fixeront à la monocouche de cellules mésothéliales. Collectez des images GFP, RFP et de phase de 20+ interactions sphéroïdes/monocouches toutes les 10 minutes, pendant 8 heures.
5. Les sphéroïdes des cellules cancéreuses de l’ovaire exprimant RFP envahiront la monocouche de cellules mésothéliales exprimant la GFP, créant un trou dans la monocouche. Après 8 heures, mesurez la taille des trous en traçant les trous noirs dans les images GFP à l’aide du logiciel Elements (ou d’un autre logiciel approprié tel que l’image J). Normalisez la taille du trou à la taille initiale du sphéroïde en divisant la taille du trou à 8 heures par la taille du sphéroïde dans l’image RFP correspondante au temps zéro. Dans cet exemple, la taille du trou n’a été mesurée qu’une seule fois, mais elle peut être mesurée plusieurs fois tout au long de l’expérience de huit heures pour mieux comprendre la dynamique de l’intercalation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
OVCA433 cellules cancéreuses de l’ovaire			Don du Dr Dennis Slamon
Cellules mésothéliales ZT			Don du Dr Tan Ince
Moyen 199	GIBCO par Life Technologies	19950
MCDB105	Cell Applications Inc.	Référence 117-500
FBS-chaleur inactivée	GIBCO, par Life Technologies	Référence 10082
Pen-Strep	GIBCO, par Life Technologies	Référence 15070
Plaques à 96 puits	Corning	Référence 3799
Polyhydroxyéthylméthacrylate (poly-HEMA) 192066-25G	Sigma-Aldrich		Pour une solution de poly-HEMA, dissoudre 6 mg de poudre de poly-HEMA dans 1 ml d’EtOH à 95 %
EtOH	Pharmco-AAPER	111ACS200	Diluer à 95 % en dH20
Hotte de culture cellulaire	Nuaire	NU-425-300
Incubateur de culture tissulaire	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Référence 3110
Incubateur pour plaques poly-HEMA 305	Instruments Labline	Impérial III
Centrifugeuse de table	Instruments Heraeus	75003429/01
Plat à fond de verre 6 puits	MatTek Corp.	P06G-1.5-20-F
Fibronectine	Sigma-Aldrich	F1141-1MG
Pbs	Cellgro	Référence 21-040-CV
microscope	Instruments Nikon		Microscope time-lapse à fluorescence motorisée inversée Ti-E avec système de mise au point parfaite intégré
lentille	Instruments Nikon		Apeture numérique 20X-0.75
Transilluminateur halogène	Instruments Nikon		Condenseur à longue distance de travail 0,52 NA
Filtres d’excitation et d’émission	Chroma Technology Corp.		GFP ex 480/40, em 525/50 RFPmCherry ex 575/50 em 640/50
Chemin de la lumière transmise et épifluoresce	Sutter Instrument Co.		Volets intelligents
Platine motorisée codée linéaire	Instruments Nikon
Appareil photo refroidi à couplage chargé	Hamamatsu Corp.	ORCA-AG
Chambre d’incubation du microscope avec contrôle de la température et du CO2			Sur mesure
Table d’isolation des vibrations	TMC
Logiciel NIS-Elements	Instruments Nikon		Édition 3