Détermination de la fréquence optimale du champ de traitement des tumeurs inhibitrices pour les cellules cancéreuses : une méthode in vitro non invasive pour évaluer l’effet des TTFields sur la viabilité des cellules cancéreuses

1. Système d’application in vitro TTFields - Entretien des plaques de base et des plats

1. Rincez la vaisselle et les couvre-plats sous l’eau courante du robinet. Ensuite, rincez à l’eau déminéralisée et séchez à l’air libre face vers le bas.
2. Si un agent chimiothérapeutique ou un médicament a été ajouté à la vaisselle lors d’une expérience antérieure, remplissez chaque boîte d’une solution détergente légère à 5 % et laissez reposer toute la nuit.
   1. Rincez abondamment la vaisselle à l’eau courante du robinet pour éviter toute trace de détergent à l’intérieur de la vaisselle. Rincez la vaisselle et les couvre-plats avec de l’eau déminéralisée et séchez-les à l’air libre sur le dos.
3. Insérez la vaisselle propre et sèche avec leurs couvercles dans des sacs de stérilisation. Fermez et placez les sacs dans un autoclave, la vaisselle face vers le bas. Autoclave pendant 30 min à une température ne dépassant pas 121 °C.
4. Mettez l’autoclave sur un programme sec, ouvrez partiellement la porte de l’autoclave et séchez la vaisselle pendant 30 min.
5. Essuyez la plaque de base avec un chiffon légèrement imbibé d’éthanol à 70 %.

2. Configuration de l’expérience

REMARQUE : Tous les équipements et matériaux utilisés dans ce protocole sont décrits dans la liste des matériaux. Toutes les étapes ci-dessous doivent être effectuées à l’intérieur d’une armoire à flux laminaire tout en maintenant des conditions stériles.

1. Préparez des plats et des couvercles TTFields propres et stériles, comme décrit dans la section 1. Essuyez la plaque de base avec un chiffon légèrement imbibé d’éthanol à 70 %.
2. Installez les plats TTFields avec les couvercles sur la plaque de base en appuyant doucement sur la boîte et en la tournant dans le sens des aiguilles d’une montre d’environ 5 mm jusqu’à ce que le bord de la parabole se verrouille sur les trois goupilles de la plaque de base. Placez une lamelle stérile de 22 mm (plastique traité ou verre) au fond de chaque plat.
3. Préparer la suspension cellulaire dans un milieu de croissance complet (milieu d'Eagle modifié de Dulbecco pour U-87 MG et F98 ; RPMI pour A2780 et OVCAR-3 ; complété comme décrit dans la liste des matériaux).
   REMARQUE : Les concentrations cellulaires dépendent des types de cellules et de la durée de l’expérience. Une croissance cellulaire confluente de 80 à 90 % ne doit pas être dépassée à la fin de l’expérience.
   ATTENTION : Les lignées cellulaires humaines peuvent représenter un danger biologique et doivent être manipulées avec les mesures de sécurité appropriées.
4. Placez 200 μL de suspension cellulaire (généralement 5 000 à 20 000 cellules dans 200 μL pour une expérience de 72 heures, en fonction du temps de doublage) en goutte au centre de chaque lamelle et couvrez avec les couvercles de la boîte.
5. Incuber à 37 °C dans un incubateur de CO₂ jusqu’à ce que les cellules adhèrent ; une incubation d’une nuit est possible à ce stade.
6. Aspirez les fluides de la goutte à l’aide d’une pipette de 200 ou 1 000 μL.
7. Pipeter doucement 2 mL de milieu de croissance complet pour remplir chaque plat. Utilisez une pointe stérile pour pipeter et tapotez doucement sur les bords de la lamelle pour libérer les bulles d’air parfois coincées sous la lame.
8. Couvrez les plats avec leurs couvercles et placez-les dans un incubateur de CO₂ à 37 °C jusqu’au début du traitement TTFields.

3. Application TTFields

1. Transférez les plaques de base avec les plats TTFields attachés dans un incubateur réfrigéré de_CO2.
   REMARQUE : L’application in vitro TTFields générera de la chaleur ; Par conséquent, un incubateur réfrigéré est nécessaire pour compenser le réchauffement de la vaisselle. Des intensités TTFields plus élevées produiront plus de chaleur et nécessiteront des températures ambiantes d’incubateur plus basses (voir tableau 1). Des intensités TTFields cliniquement pertinentes sont atteintes lorsque la température de l’incubateur pour l’application TTFields est comprise entre 18 et 30 °C.
2. Connectez le connecteur femelle du câble plat à la plaque de base. Allumez le générateur TTFields.
3. Démarrez le logiciel système d’application in vitro TTFields et sélectionnez les paramètres de l’expérience.
   1. Définissez une nouvelle expérience. Tapez le nom de l’expérience et le propriétaire de l’expérience dans l’interface utilisateur du logiciel sur l’écran de l’ordinateur. Ajustez la fréquence et la température cible de chaque plat ou plaque de base.
4. Démarrez l’application TTFields à l’aide du logiciel.
5. Vérifiez que toutes les paraboles sont correctement connectées et qu’elles apparaissent en bleu clair sur le moniteur. Si une parabole est entourée d’un cadre rouge (ce qui signifie qu’elle n’est pas correctement connectée), appuyez doucement dessus et tournez-la lentement d’avant en arrière jusqu’à ce que les contacts soient rétablis et que la parabole apparaisse en bleu clair.
6. Laissez le système d’application in vitro TTFields fonctionner jusqu’à 24 h.
7. Si l’expérience atteint son point final, arrêtez-la en cliquant sur le bouton TERMINER L’EXPÉRIENCE dans le logiciel et passez à l’étape 5. Si ce n’est pas le cas, cliquez sur PAUSE expérience.
8. Débranchez le connecteur du câble plat de la plaque de base. Retirez la plaque de base avec les plats de l’incubateur dans une armoire à flux laminaire.
9. Remplacez le milieu dans tous les plats toutes les 24 h et remettez la plaque de base dans l’incubateur réfrigéré. Connectez la plaque de base au générateur à l’aide du câble plat. Poursuivez l’expérience en cliquant sur le bouton CONTINUER.

Table 1. Température ambiante de l’incubateur et intensités TTFields attendues à l’intérieur de la parabole TTFields.

4. Échantillons de contrôle

Remarque : Cultivez des cellules témoins dans des conditions similaires à celles des cellules traitées par TTFields, à l’exclusion de l’application TTFields.

1. Échantillons de contrôle sur plaque avec la même suspension et sur une surface similaire que celle utilisée pour le placage d’échantillons traités par TTFields.
2. Placez les plats témoins dans un incubateur de CO₂ à 37 °C.
3. Remplacez le milieu dans les plats toutes les 24 h pour correspondre aux conditions du milieu de plat traité TTFields.

5. Fin de l’expérience

1. Après avoir cliqué sur TERMINER L’EXPÉRIENCE, attendez que le logiciel récupère tous les enregistrements du système et sauvegarde les enregistrements sur l’ordinateur.
2. Utilisez le bouton RAPPORTS pour consulter les fichiers journaux de température, de courant et de résistance de chaque plaque de base afin de vérifier que toutes les paraboles ont été traitées conformément au plan expérimental.
   REMARQUE : Tous les rapports et journaux sont sauvegardés sur l’ordinateur après la fin de l’expérience et peuvent être consultés à tout moment.
3. Éteignez le générateur TTFields.
4. Débranchez le câble plat de la plaque de base et retirez-le de l’incubateur.
5. Pour retirer un plat en céramique, appuyez et tournez le plat dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour le déverrouiller de la plaque de base.
6. Placez la vaisselle dans une armoire à flux laminaire et retirez les lamelles de manière aseptique. Transférez-les dans des boîtes de Pétri stériles contenant un milieu frais ou une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour une inspection et une évaluation plus approfondies.