Fenêtrage d’œuf : une méthode d’ouverture de la coquille d’œuf de poule fécondée pour exposer la vascularisation de la membrane chorioallantoïde

Résumé

Source : Sharrow, A. C. et al. Utilisation du modèle in vivo de membrane chorioallantoïde de poulet pour étudier les cancers gynécologiques et urologiques. J. Vis. Exp. (2020)

Dans cette vidéo, nous décrivons une technique pour ouvrir la coquille d’un œuf de poule fécondé afin d’exposer sa membrane chorioallantoïdienne ou CAM portant un réseau de vaisseaux sanguins ramifiés. Le CAM exposé peut être utilisé pour la modélisation tumorale in ovo.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des embryons d’œufs de poule ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation des œufs

1. Avant de recevoir les œufs, assemblez et équilibrez l'incubateur d'œufs à 37,8 °C (100 °F) avec 60 à 70 % d'humidité en suivant les instructions du fabricant.
   note: Pour minimiser les risques de contamination, de l’eau autoclavée peut être utilisée pour contrôler l’humidité.
2. Après avoir reçu des œufs de poule Rhode Island Red fécondés d’un fournisseur d’œufs de laboratoire certifié, essuyez à sec la surface des coquilles avec des serviettes en papier. Une serviette en papier légèrement humide peut être utilisée pour enlever le matériau collé. Sécher immédiatement.
   note: Mouiller la coquille avec un liquide inférieur à 43,3 °C peut introduire des bactéries dans l’œuf. Si l’on choisit de laver ou de désinfecter les œufs, la température du liquide doit être comprise entre 43,3 et 48,9 °C. Des températures plus élevées peuvent faire bouillir les œufs. Le choix du désinfectant doit être fait en fonction des micro-organismes préoccupants.
3. Utilisez un crayon ou un marqueur pour étiqueter la date sur l’œuf. Ceci est considéré comme le jour de développement 0.
4. Placez les œufs dans l’incubateur d’œufs et incubez pendant au moins 7 jours en rotation pour permettre le développement de CAM. Un rotateur automatique peut être utilisé, ou les œufs peuvent être tournés à 180° 2 à 3 fois par jour.

2. Ouverture des œufs

REMARQUE : L’ouverture des œufs doit se faire lorsque le CAM est complètement développé. C’est généralement le jour 7 ou 8 du développement.

1. Désinfectez une enceinte de biosécurité avec 70 % d’éthanol. De même, désinfectez et placez dans l’enceinte de biosécurité un support à œufs, une bougie à œufs, un marqueur, un outil rotatif sans fil avec une meule en carbure de silicium et une roue de coupe circulaire, une aiguille 18 G, un contrôleur de pipette avec tube à vide d’un quart de pouce, du ruban d’emballage, des ciseaux de bureau, des ciseaux courbes, des pinces Semken (ou similaires), des boules de coton et un pansement transparent de 6 x 7 cm. Dans la mesure du possible, utilisez des outils stériles, jetables ou autoclavés.
2. Éteignez le rotateur d’œufs. Placez environ 1 à 3 œufs dans l’enceinte de sécurité biologique sur le support à œufs. Dans l’obscurité, placez la bougie d’œuf contre la coquille d’œuf pour identifier la cellule d’air. Marquez l’emplacement de l’air cell.
   note: L’intensité de l’éclairage du chandelier de l’œuf est cruciale pour visualiser l’intérieur de l’œuf. Si la pile à air ou le système vasculaire est constamment difficile à voir, essayez de remplacer les piles de la bougie de l’œuf.
3. Déplacez la bougie d’œuf sur la coquille pour trouver un grand réseau de vaisseaux sanguins. Faites pivoter l’œuf si nécessaire. Un système vasculaire idéal se ramifiera près du milieu de l’œuf. Utilisez un marqueur pour dessiner sur le système vasculaire à utiliser pour l’implantation.
4. Allumez la lumière dans le capot. À l’aide d’un outil rotatif sans fil équipé d’une meule en carbure de silicium, percez un petit trou dans la coque directement au centre de la cellule d’air. Percez jusqu’à ce que la majeure partie de la coquille ait été enlevée, mais que la membrane intérieure blanche soit intacte.
   note: Le forage au-dessus de la cellule d’air avant de cibler le système vasculaire permet de déterminer l’épaisseur de cette coquille d’œuf particulière au-dessus de la cellule d’air plutôt que sur le CAM et le système vasculaire. Si la CAM ou le système vasculaire est perturbé, l’ovule n’est pas utilisable pour l’implantation.
5. Percez et ouvrez un autre petit trou où la fenêtre vasculaire sera ouverte comme cela a été fait pour la cellule d’air (étape 2.4).
6. À l’aide d’une aiguille de 18 G, percez doucement la membrane intérieure blanche au-dessus de la cellule d’air et du système vasculaire. S’il ne parvient pas à pénétrer dans l’obus, percez soigneusement un peu plus. Assurez-vous que la membrane intérieure blanche (mais pas le CAM) est perturbée sur toute la surface percée. Il n’est pas nécessaire de retirer la membrane de la pièce.
   note: Si le CAM ou le système vasculaire est perturbé pendant cette étape, jetez l’œuf. Les dommages sont évidents s’il y a du sang ou de l’albumine qui s’échappe d’un trou percé.
7. Éteignez la lumière du capot. À l’aide du chandelier à œufs, vérifiez que la cellule d’air a été transférée de l’extrémité de l’œuf à la zone située au-dessus du système vasculaire. Si nécessaire, placez le tube à vide inséré dans un contrôleur de pipette autour du trou au-dessus de la cellule d’air d’origine et appliquez doucement l’aspiration par courtes rafales pour déplacer la cellule d’air.
8. À l’aide d’un marqueur, tracez le nouvel emplacement de la cellule d’air à environ 0,5 cm à l’intérieur de la limite air-CAM. Fixez un morceau de ruban adhésif juste au-dessus de la nouvelle cellule d’air. Si nécessaire, utilisez des ciseaux de bureau standard pour couper le ruban à une taille appropriée.
   note: Le ruban adhésif peut perturber la circulation de l’air à travers la coque et ne doit pas être plus grand que nécessaire pour couvrir complètement la cellule d’air.
9. Remettez les œufs dans l’incubateur pour qu’ils se réchauffent sans rotation, la nouvelle cellule d’air vers le haut. Répétez les étapes 2.2 à 2.9 pour ouvrir les œufs restants.
   note: Le protocole peut être mis en pause ici. En cas de doute sur la qualité du développement de la CAM, un petit nombre d’œufs doit passer par l’étape 2.16 avant d’ouvrir les œufs restants.
10. Placez environ 1 à 3 œufs avec des cellules d’air déplacées sur le support à œufs dans l’enceinte de biosécurité.
    note: Il faut veiller à ne pas introduire de contamination dans l’œuf ouvert. Par conséquent, ouvrez toujours les œufs à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité et utilisez des outils et du matériel stériles dans la mesure du possible.
11. À l’aide d’un outil rotatif sans fil équipé d’une molette de coupe circulaire, coupez une petite ligne au-dessus de la limite de la cellule d’air tracée à l’étape 2.8. Assurez-vous qu’il se trouve à environ 0,5 cm à l’intérieur de la limite air-CAM réelle pour éviter de perturber le CAM ou le système vasculaire. Coupez complètement la coquille mais veillez à ne pas pénétrer assez profondément pour perturber le CAM ou le système vasculaire.
12. À l’aide de ciseaux incurvés, coupez autour de la cellule d’air restante pour créer une fenêtre dans la coquille.
    note: Si du sang ou une membrane est présent sur la coquille retirée, l’ovule ne convient pas à l’implantation. Si une grande proportion des œufs ne sont pas ouverts proprement, envisagez d’attendre au moins 1 jour supplémentaire pour ouvrir les œufs restants afin de permettre une meilleure formation de CAM. Si la coquille des œufs restants n’a pas été percée, la rotation des œufs à l’intérieur de l’incubateur doit reprendre.
13. Vérifier la viabilité de l’embryon. Les embryons viables présenteront une vascularisation étendue, une albumine claire, un mouvement embryonnaire ou un rythme cardiaque visible.
14. À l’aide d’une pince Semken, retirez de petits morceaux de coton d’une boule de coton stérile. Épongez doucement la surface CAM pour enlever la poussière et les débris de la coquille.
    note: L’enlèvement des débris doit être effectué le jour même de l’ouverture des œufs.
15. Couvrez l’ouverture de la coquille avec un quart de film transparent de 6 x 7 cm.
16. Remettez les œufs dans l’incubateur. Assurez-vous que l’œuf est bien en place, que la fenêtre ouverte est tournée vers le haut et que le CAM ne touche pas le pansement transparent. Utilisez un morceau de support à œufs, le bord du rotateur d’œufs ou un autre élément approprié pour soutenir les œufs qui continuent de rouler.
17. Répétez les étapes 2.10 à 2.16 pour tous les œufs restants à ouvrir.
    note: Il n’est pas nécessaire que l’ouverture des ovules soit terminée le même jour que l’implantation. Attendre au moins 1 jour peut aider à éliminer les œufs dont la viabilité a été compromise par l’ouverture de la coquille.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Roboz Chirurgical	Réf. RS6703		Ceci est fourni à titre d’exemple. N’importe quel ciseau incurvé similaire travailler aussi.
Dremel	Référence 8050-N/18		Ce kit contient tout le nécessaire outils.
AA Lab Eggs Inc.	n/a		Un fournisseur local d’œufs devrait être identifié, en tant que ce fournisseur uniquement livre à l’échelle régionale.
Entrepôt incubateur	HB1588D-AUCUN-1102-1588-1357		D’autres incubateurs d’œufs peuvent être utilisés, mais leur fiabilité devrait être Vérifié. Après l’implantation, une cellule incubateur avec le CO2 désactivé peut également être utilisé.
Entrepôt incubateur	Référence 1102		D’autres chandeliers peuvent être utilisés ; cependant, cette option est préférée parmi les ceux que nous avons testés. Ce chandelier est inclus dans le kit d’incubation susmentionné.
Instrument de précision mondial	Référence 15915		Ceci est fourni à titre d’exemple. Toute pince incurvée similaire travailler aussi. Plusieurs marques ont utilisé pour cette méthode.
Bd	305196		Ceci est fourni à titre d’exemple. N’importe quelle aiguille 18G fonctionnerait de la même façon.
Outils scientifiques fins	Référence 11008-13		Ceci est fourni à titre d’exemple. Toute pince similaire ou autre style qui correspond à la préférence du chercheur serait approprié.
Sciences de la microscopie électronique	Référence 72914		Ceci est fourni à titre d’exemple. La pince utilisée pour s’éloigner La coque pour la bioluminescence mesure environ 12,8 cm Long avec des pointes de 3 mm de large.
Fisherbrand	Tél. : 22-456-885		Ceci est fourni à titre d’exemple. N’importe quelle boule de coton stérile suffire.
Moore Médical	Référence 21272
Corning	353803		Ceci est fourni à titre d’exemple. Toute parabole stérile similaire de 10 cm peut être utilisé. Traitement par culture tissulaire n’est pas nécessaire.
Tygon	AACUN017		Ceci est fourni à titre d’exemple. Tout tube de taille similaire travailler aussi.