Modélisation du cancer basée sur la membrane chorioallantoïde du poulet : un modèle in ovo pour étudier la tumorigenèse et les métastases des cellules cancéreuses

Résumé

Source : Sharrow, A. C. et al. Utilisation du modèle in vivo de membrane chorioallantoïde de poulet pour étudier les cancers gynécologiques et urologiques. J. Vis. Exp.(2020)

Dans cette vidéo, nous décrivons l’implantation de cellules cancéreuses sur une membrane chorioallantoïde de poulet pour générer un modèle in ovo. Le modèle greffe avec succès les cellules cancéreuses de l’ovaire pour étudier la progression du cancer gynécologique.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation de la suspension de cellules cancéreuses pour la transplantation (option 1)

REMARQUE : Cette opération doit être effectuée juste avant l’implantation, qui devrait idéalement avoir lieu entre les jours 7 et 10. Veuillez consulter les notes au début de l’étape 3 ou 4 pour plus d’informations concernant la date d’implantation. Cette approche a été utilisée pour toutes les lignées cellulaires et les digestions de tumeurs cancéreuses du rein en culture.

1. Décongeler la solution de matrice extracellulaire sur de la glace.
2. En utilisant la digestion mécanique et/ou enzymatique, obtenir une suspension unicellulaire en utilisant une méthode appropriée au type de cellule implanté.
3. Remettre en suspension le nombre total de cellules à implanter dans un milieu approprié pour l’implantation. Les implants de 1-2 x 10⁶ cellules par ovule sont typiques.
   note: Le milieu utilisé pour l’implantation des lignées cellulaires est généralement le milieu complet utilisé pour la culture des cellules, contenant le FBS ou le remplacement du sérum. L’implantation de digestions tumorales utilise généralement le milieu complet utilisé pour la culture de lignées cellulaires du même type de cancer. Cependant, des ajustements à la formulation du milieu peuvent être effectués si nécessaire à titre expérimental. Les effets sur le développement et la croissance tumorale devraient être déterminés empiriquement.
4. Granulez les cellules à l’aide d’une vitesse et d’un temps de centrifugeuse adaptés aux cellules utilisées. Les vitesses typiques sont de 250 à 300 x g et les temps sont de 5 à 10 minutes.
5. Retirer le surnageant des cellules granulées par pipetage. Remettre mécaniquement les cellules en suspension dans le milieu résiduel par effleurement ou pipetage. Placer sur de la glace pour refroidir. Mesurez le volume des cellules et du milieu à l’aide d’une pipette de taille appropriée.
6. Calculer les volumes d’implantation de telle sorte que 1-2 x 10⁶ cellules soient implantées dans un volume de 20-100 μL par ovule avec une concentration finale de matrice extracellulaire de 2,7-4 mg/mL de protéines. Ajouter le milieu, les facteurs de croissance ou additifs souhaités et la solution de matrice extracellulaire selon ce calcul. Garder sur la glace jusqu’au moment de l’implantation.
   note: Pour les calculs des étapes 1.3 et 1.6, un volume supplémentaire d’au moins un demi-œuf implant doit être incorporé pour assurer un volume adéquat pour tous les ovules du groupe. Pour l’implantation des lignées cellulaires du cancer de l’ovaire (c’est-à-dire SKOV3 et ID8), 10^{à 6} cellules par ovule ont été implantées. Pour l’implantation de la lignée cellulaire de carcinome à cellules rénales RENCA, de cellules cultivées dérivées d’un carcinome rénal humain primaire digéré, de lignées cellulaires de cancer de la prostate (c.-à-d. CWR, C4-2 et MyC-CaP) et de lignées cellulaires de cancer de la vessie (c.-à-d. HT-1376 et T24), 2 x 10^{cellules 6} ont été implantées.

2. Préparation des morceaux tumoraux pour l’implantation (option 2)

REMARQUE : Cette opération doit être effectuée juste avant l’implantation, qui devrait idéalement avoir lieu entre les jours 7 et 10. Veuillez consulter les notes au début de l’étape 3 ou 4 pour plus d’informations concernant la date d’implantation. Les cancers primitifs de l’ovaire et de la vessie ont été implantés sous forme de morceaux tumoraux.

1. Décongeler une solution de matrice extracellulaire sur de la glace. Diluer jusqu’à une concentration finale en protéines de 2,7 à 4 mg/mL dans un milieu approprié contenant les facteurs de croissance ou les additifs souhaités. Garder sur la glace.
   note: L’implantation de morceaux tumoraux utilise généralement le milieu complet utilisé pour la culture de lignées cellulaires du même type de cancer. Cependant, des ajustements à la formulation du milieu peuvent être effectués si nécessaire à titre expérimental. Les effets sur la greffe et la croissance tumorale devraient être déterminés empiriquement.
2. À l’aide d’un scalpel ou de ciseaux, excisez des morceaux de la tumeur fraîche. Les tailles idéales vont de 2 à 5 mm de chaque côté. Gardez les tissus immergés dans le milieu jusqu’au moment de l’implantation.

3. Implantation à l’aide d’un anneau antiadhésif (option 1)

REMARQUE : Les cellules peuvent être implantées à partir du jour de développement 7 si le CAM est complètement développé. L'implantation peut avoir lieu à tout moment avant l'éclosion, ce qui laisse suffisamment de temps pour le développement de la tumeur et l'expérience souhaitée, mais notez que les cellules immunitaires de l'embryon commencent à être présentes vers le 10e jour après la fécondation. Le taux de croissance tumorale varie considérablement selon le type de cellule et doit être déterminé empiriquement pour le type de cellule d’intérêt. Les cellules cancéreuses de l’ovaire et de la prostate ont été implantées à l’aide de la méthode de l’anneau antiadhésif. Notez que lorsqu’une bague antiadhésive n’est pas disponible, une pointe de pipette peut être coupée à une taille similaire et utilisée.

1. Utilisez de l’éthanol à 70 % pour désinfecter une enceinte de biosécurité et tous les outils nécessaires : un support à œufs, une pince à iris incurvée, des anneaux antiadhésifs (1/4 de pouce de diamètre intérieur), une tige d’agitation en verre, des pipettes et des pointes de volume approprié, un pansement en film transparent de 6 x 7 cm, des ciseaux de bureau et un marqueur ou un crayon. Dans la mesure du possible, des outils stériles, jetables ou autoclavés doivent être utilisés.
2. Placez les œufs à implanter sur un support à œufs dans une enceinte de biosécurité. Sélectionnez un nombre gérable d’œufs. Jusqu’à six est typique. Évitez de laisser les œufs refroidir considérablement pendant que vous les utilisez.
3. Retirez le film transparent de la coquille en roulant les bords vers la fenêtre ouverte pour éviter d’arracher des morceaux de coquille. Vérifiez que les œufs sont viables et sains. Les œufs idéaux auront un grand récipient au centre de la zone ouverte avec des récipients plus petits qui se ramifient à partir de celui-ci.
4. À l’aide d’une pince à iris incurvée, placez un anneau stérile et antiadhésif sur le CAM au-dessus du vaisseau, idéalement au-dessus d’un point de branche. Utilisez une tige d’agitation en verre stérile pour abraser doucement le CAM.
5. Pipetez la suspension de la cellule de l’étape 1.6 au centre de l’anneau antiadhésif. Alternativement, à l’aide d’une pince, placez un morceau de tumeur de l’étape 2.2 au centre de l’anneau antiadhésif et couvrez avec 20 à 50 μL de la solution de matrice extracellulaire générée à l’étape 2.1.
6. Scellez l’ouverture à l’aide d’un quart de film transparent de 6 x 7 cm. Étiquetez les ovules avec une désignation d’implant appropriée.
   note: La numérotation des œufs au sein d’un groupe facilite les observations longitudinales.
7. Remettez l’œuf dans l’incubateur. Assurez-vous que l’ouverture de la coquille est bien droite et que l’œuf est bien en place.
   note: Les œufs peuvent être renvoyés dans un incubateur d’œufs sans rotation. Alternativement, une viabilité post-implantaire élevée peut être obtenue à l’aide d’un incubateur de cellules à 37-38 °C avec le CO₂ désactivé et d’un hygromètre pour surveiller l’humidité, qui doit être de 50 à 80 %.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
010 Joints toriques en téflon (PTFE) blanc 55 Duro Shore D	Le magasin de joints toriques	TEF010	Anneau antiadhésif pour l’ensemencement cellulaire. 1/4 « ID X 3/8 » OD X 1/16 « CS Polytétrafluoroéthylène (PTFE).
Ciseaux d’opération délicats ; Courbé; Tranchant-tranchant ; Longueur de lame de 30 mm ; 4-3/4 po Longueur totale	Roboz Chirurgical	Réf. RS6703	Ceci est fourni à titre d’exemple. Des ciseaux incurvés similaires fonctionneraient également.
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Kit d’outils	Dremel	Référence 8050-N/18	Ce kit contient tous les outils nécessaires
Œufs de poule fécondés (Rhode Island Red - Brown, Lab Grade)	AA Lab Eggs Inc.	n/a	Il faudrait identifier un fournisseur local d’œufs, car ce fournisseur ne livre qu’à l’échelle régionale.
Hovabator Genesis 1588 Kit combiné d’incubateur d’œufs de luxe	Entrepôt incubateur	HB1588D-AUCUN-1102-1588-1357	D’autres incubateurs d’œufs peuvent être utilisés, mais leur fiabilité devrait être vérifiée. Après l’implantation, un incubateur de cellules avec le CO2 désactivé peut également être utilisé.
Incu-Bright Cool Light Oeuf Chandelier	Entrepôt incubateur	Référence 1102	D’autres chandeliers peuvent être utilisés, mais celui-ci est préféré parmi ceux que nous avons testés. Ce chandelier est inclus dans le kit d’incubateur susmentionné.
matrice membranaire matrigel HC ; Sans LDEV	Corning	354248	Solution de matrice extracellulaire
SKOV3	ATCC	HTB-77	Lignée cellulaire du cancer de l’ovaire humain.
Tiges d’agitation avec policier en caoutchouc ; 5 mm de diamètre, 6 po de longueur	Fournitures scientifiques unies	GRPL06	Ceci est fourni à titre d’exemple. N’importe quelle tige d’agitation en verre similaire fonctionnerait également.
Pince à échantillon	Sciences de la microscopie électronique	Référence 72914	Ceci est fourni à titre d’exemple. Les pinces utilisées pour retirer la coquille pour l’imagerie par bioluminescence mesurent environ 12,8 cm de long avec des pointes de 3 mm de large.