1. Traitement des organoïdes pour l’histologie : la méthode de centrifugation de l’agarose
NOTE : Ce protocole est adapté d’une publication précédente de Vlachogiannis et al. Nous avons ajouté une étape impliquant l’enrobage d’agarose pour intégrer avec succès toutes les populations d’organoïdes.
- Retirez le support existant du puits. Attention à ne pas aspirer les dômes de la membrane basale.
- Ajouter un volume égal (égal au volume de milieu retiré de l’étape 1) de solution de récupération cellulaire et incuber pendant 60 min à 4 °C.
- Déloger le dôme de la membrane basale à l’aide d’une pipette et écraser le dôme de la membrane basale à l’aide d’une pointe de pipette. Prélever la solution de récupération du dôme dissocié et de la cellule dans un tube de 1,5 mL.
- Centrifugeuse à 300 x g et 4 °C pendant 5 min.
- Retirer le surnageant (solution de récupération cellulaire). Conservez tous les surnageants dans des tubes séparés jusqu’à la fin, lorsque la présence d’organoïdes est confirmée lors de l’étape finale de granulation.
- Ajoutez le volume désiré (tableau 1) de PBS froid et pipetez doucement de haut en bas pour perturber mécaniquement la pastille.
- Centrifugeuse à 300 x g et 4 °C pendant 5 min.
- Retirez le surnageant (PBS).
- Fixer la pastille dans un volume correspondant (p. ex., 500 μL pour une pastille dans des conditions de culture sur plaque à 24 puits, tableau 1) de 4 % de PFA pendant 60 min à température ambiante.
- Après fixation, centrifuger à 300 x g et 4 °C pendant 5 min.
- Retirez le surnageant (PFA).
- Laver avec un volume adapté (p. ex., 500 μL pour une pastille à partir de la condition de culture sur plaque à 24 puits, tableau 1) du PBS et centrifuger à 300 x g et 4 °C pendant 5 min.
- Préparez l’agarose chaude (2 % d’agarose dans le PBS).
note: Ici, les granulés cellulaires pour les sections congelées peuvent être directement remis en suspension dans 200 μL de composé OCT.
- Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 200 μL d’agarose (2 % dans le PBS).
- Immédiatement après l’ajout de l’agarose, détachez doucement la pastille de la paroi du tube de 1,5 ml à l’aide de l’aiguille de 25 g fixée à la seringue de 1 ml. Comme le montre la figure 1, si la pastille de cellule n’est pas physiquement détachée de la paroi du tube de 1,5 mL, il y a un risque de perdre la totalité ou une partie de la pastille de cellule pendant le processus d’enrobage de l’agarose.
- Attendez que l’agarose à 2 % du PBS soit complètement solidifié.
- Détachez le bloc d’agarose solidifié du tube de 1,5 mL à l’aide d’une aiguille de 25 G fixée à la seringue de 1 mL.
- Transférez le bloc d’agarose détaché contenant la pastille de cellule dans un nouveau tube de 1,5 ml.
- Remplissez le tube avec 70 % d’EtOH et poursuivez en utilisant le protocole conventionnel de déshydratation des tissus et d’enrobage de paraffine.
Tableau 1 : Densité d’ensemencement, volume de la membrane basale et volume moyen nécessaire pour un dôme
| Plaque de culture | Densité de semis (cellules) | Volume de la membrane basale (μL) | Moyenne (μL) |
| 48 puits | De 25 000 à 50 000 | 20 | 250 |
| 24 puits | De 50 000 à 250 000 | 40 | 500 |
| 6 puits | De 50 000 à 250 000 | 40 | 2 000 |
