Dosage de l’agarose : une technique pour intégrer des organoïdes pour l’analyse histologique

1. Traitement des organoïdes pour l’histologie : la méthode de centrifugation de l’agarose

NOTE : Ce protocole est adapté d’une publication précédente de Vlachogiannis et al. Nous avons ajouté une étape impliquant l’enrobage d’agarose pour intégrer avec succès toutes les populations d’organoïdes.

1. Retirez le support existant du puits. Attention à ne pas aspirer les dômes de la membrane basale.
2. Ajouter un volume égal (égal au volume de milieu retiré de l’étape 1) de solution de récupération cellulaire et incuber pendant 60 min à 4 °C.
3. Déloger le dôme de la membrane basale à l’aide d’une pipette et écraser le dôme de la membrane basale à l’aide d’une pointe de pipette. Prélever la solution de récupération du dôme dissocié et de la cellule dans un tube de 1,5 mL.
4. Centrifugeuse à 300 x g et 4 °C pendant 5 min.
5. Retirer le surnageant (solution de récupération cellulaire). Conservez tous les surnageants dans des tubes séparés jusqu’à la fin, lorsque la présence d’organoïdes est confirmée lors de l’étape finale de granulation.
6. Ajoutez le volume désiré (tableau 1) de PBS froid et pipetez doucement de haut en bas pour perturber mécaniquement la pastille.
7. Centrifugeuse à 300 x g et 4 °C pendant 5 min.
8. Retirez le surnageant (PBS).
9. Fixer la pastille dans un volume correspondant (p. ex., 500 μL pour une pastille dans des conditions de culture sur plaque à 24 puits, tableau 1) de 4 % de PFA pendant 60 min à température ambiante.
10. Après fixation, centrifuger à 300 x g et 4 °C pendant 5 min.
11. Retirez le surnageant (PFA).
12. Laver avec un volume adapté (p. ex., 500 μL pour une pastille à partir de la condition de culture sur plaque à 24 puits, tableau 1) du PBS et centrifuger à 300 x g et 4 °C pendant 5 min.
13. Préparez l’agarose chaude (2 % d’agarose dans le PBS).
    note: Ici, les granulés cellulaires pour les sections congelées peuvent être directement remis en suspension dans 200 μL de composé OCT.
14. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 200 μL d’agarose (2 % dans le PBS).
    1. Immédiatement après l’ajout de l’agarose, détachez doucement la pastille de la paroi du tube de 1,5 ml à l’aide de l’aiguille de 25 g fixée à la seringue de 1 ml. Comme le montre la figure 1, si la pastille de cellule n’est pas physiquement détachée de la paroi du tube de 1,5 mL, il y a un risque de perdre la totalité ou une partie de la pastille de cellule pendant le processus d’enrobage de l’agarose.
15. Attendez que l’agarose à 2 % du PBS soit complètement solidifié.
16. Détachez le bloc d’agarose solidifié du tube de 1,5 mL à l’aide d’une aiguille de 25 G fixée à la seringue de 1 mL.
17. Transférez le bloc d’agarose détaché contenant la pastille de cellule dans un nouveau tube de 1,5 ml.
18. Remplissez le tube avec 70 % d’EtOH et poursuivez en utilisant le protocole conventionnel de déshydratation des tissus et d’enrobage de paraffine.

Tableau 1 : Densité d’ensemencement, volume de la membrane basale et volume moyen nécessaire pour un dôme

Figure 1 : Une étape clé pour un enrobage réussi de l’agarose. Procédé permettant de détacher la pastille de cellule de la paroi du tube de 1,5 ml.