1. Placage de cellules épithéliales de prostate triées dans une culture d’organoïdes primaires de souris — DURÉE : 2-3 H (à l’exclusion de la préparation de la plaque revêtue de poly-HEMA)
REMARQUE : Les plaques sont recouvertes de Poly-HEMA pour empêcher la formation de colonies 2D à la surface du puits sous le gel matriciel. Préparez des plaques revêtues de Poly-HEMA 1 jour avant de plaquer les cellules épithéliales basales ou luminales de la prostate triées dans une culture d’organoïdes de souris. Décongeler 1 mL d’aliquotes de gel matriciel à facteur de croissance réduit, ci-après appelé gel matriciel, sur de la glace 2 h avant l’étape 1.1. L’Y-27632 (inhibiteur de ROCK) doit être ajouté au milieu organoïde de souris immédiatement avant l’étape 1.1. Effectuez les étapes 1.1 à 1.8 sur de la glace.
- Granuler les cellules dans des tubes à fond rond de 5 mL par centrifugation à 800 x g pendant 5 min à 4 °C et aspirer le surnageant.
- Laver la pastille cellulaire dans 500 μL de milieu organoïde de souris (tableau 1).
- Granuler les cellules par centrifugation à 800 x g pendant 5 min à 4 °C et aspirer le surnageant.
- Remise en suspension dans un milieu organoïde de souris à une densité cellulaire de 1 000 cellules/μL.
- Pour préparer des mélanges maîtres, mélangez des cellules épithéliales en suspension dans un milieu organoïde de souris avec un gel matriciel pour générer un mélange final contenant 25 % de cellules/milieux et 75 % de gel matriciel. Les cellules basales sont généralement plaquées à une concentration de 100 à 2 000 cellules/80 μL, tandis que les cellules luminales sont généralement plaquées à une concentration de 2 000 à 10 000 cellules/80 μL. La densité des cellules plaquées varie en fonction du jour de collecte prévu du matériau et de l’application en aval souhaitée.
REMARQUE : Refroidissez le(s) tube(s) de taille appropriée pour le volume de mélange principal prévu 5 min avant la préparation du mélange principal. Pour s’assurer que le gel matriciel ne durcit pas lors de la manipulation, il est essentiel de refroidir la pointe de la pipette en pipetant le gel matriciel 3 à 4 fois avant de le transférer dans un nouveau tube.
- Ajouter 80 μL du mélange matricielle gel/cellule par puits d’une plaque à 24 puits. Il est recommandé de pipeter une gouttelette sur la moitié inférieure de la paroi du puits, tout en évitant le contact direct avec le revêtement Poly-HEMA. Après avoir ajouté le gel matriciel, faites tourner la plaque pour permettre au mélange gel/cellule matriciel de former un anneau autour du bord du puits.
- Placez la plaque à 24 puits dans un incubateur à 37 °C 5 % de CO2 à l’endroit pendant 10 min pour permettre au gel matriciel de durcir partiellement.
REMARQUE : Commencez à réchauffer le milieu organoïde de souris à 37 °C immédiatement après avoir placé la plaque à 24 puits dans l’incubateur.
- Après 10 minutes d’incubation, retournez la plaque à 24 puits et incubez pendant 50 minutes supplémentaires pour permettre au gel matriciel de durcir complètement.
- Ajouter 350 μL de média organoïde de souris préchauffé goutte à goutte au centre de chaque puits.
REMARQUE : Pour maintenir l’intégrité du gel matriciel, il est essentiel d’éviter l’anneau de gel matriciel lors de l’ajout de support.
- Après avoir ajouté le milieu, remettez la plaque à 24 puits dans l’incubateur à 37 °C à 5 % de CO2.
2. Réapprovisionnement des milieux organoïdes de souris — CHRONOMÉTRAGE : 10-15 min par plaque à 24 puits
REMARQUE : Les supports existants doivent être remplacés par des supports neufs toutes les 48 h. Avant chaque changement de support, préchauffez le support organoïde de souris. Il n’est pas nécessaire d’ajouter l’inhibiteur de ROCK au milieu utilisé pour le réapprovisionnement.
- Inclinez la plaque à 24 puits à un angle de 45° et retirez délicatement le média existant du centre de chaque puits à l’aide d’une pipette P1000 tout en évitant l’anneau de gel matriciel.
- Ajouter 350 μL de support organoïde de souris préchauffé comme à l’étape 1.9. Il est recommandé d’ajouter un plus grand volume de milieu (jusqu’à 1 ml) aux organoïdes cultivés pendant plus de 5 jours afin d’éviter l’épuisement rapide des nutriments clés et des facteurs de croissance.
Tableau 1 : Instructions pour la préparation des milieux organoïdes de souris
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composant
| concentration
|
| B-27 | 1x (diluer à partir de 50x concentré) |
| GlutaMAX | 1x (diluer à partir de 100x concentré) |
| N-acétyl-L-cystéine | 1,25 million d’euros |
| Normocin | 50 μg/mL |
| EGF humain recombinant, sans animaux | 50 ng/mL |
| Noggin humain recombinant | 100 ng/mL |
| Milieux conditionnés à la R-spondine 1 | 10 % de supports conditionnés |
| N° A83-01 | 200 nM |
| DHT | 1 nM |
| Dichlorhydrate d’Y-27632 (inhibiteur de ROCK) | 10 μM |
| DMEM/F-12 avancé | Média de base |
| R-spondin 1-le milieu conditionné est généré comme décrit dans Drost et al. Après l’ajout de tous les composants, le filtre stérilise le média organoïde de souris à l’aide d’un filtre de 0,22 μm. L’inhibiteur de ROCK n’est ajouté que lors de l’établissement de la culture et du passage des organoïdes. |
