L’extraction au lysat de protéines : une technique pour lyser des organoïdes afin de collecter des protéines cellulaires

Résumé

Source : Crowell, P. D. et al. Évaluation de la capacité de différenciation des cellules épithéliales de la prostate de souris à l’aide de la culture organoïde. J. Vis. Exp. (2019)

Dans cette vidéo, nous démontrons l’extraction de lysats protéiques à partir d’organoïdes de la prostate cultivés dans un anneau matriciel de membrane basale. L’analyse des fractions protéiques extraites peut aider à étudier l’expression des marqueurs de lignée dans les organoïdes.

Protocole

1. Extraction du lysat de protéines à partir d’organoïdes de la prostate pour l’analyse par transfert Western — DURÉE : 2,5-4 H

REMARQUE : Avant de prélever des organoïdes pour l’extraction du lysat de protéines, préparer et préchauffer les milieux contenant des dispases (Tableau 1).

1. Retirez le média de chaque puits en inclinant la plaque de 24 puits à un angle de 45° et en retirant délicatement le média existant du centre de chaque puits à l’aide d’une pipette P1000 tout en évitant l’anneau de gel matriciel.
2. Pour prélever des organoïdes, soufflez à plusieurs reprises le gel matriciel en pipetant 1 mL de milieu contenant de la dispase directement sur l’anneau de gel matriciel jusqu’à ce que tout l’anneau soit délogé, puis transférez-le dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
   REMARQUE : Il est essentiel d’éviter tout contact direct avec les puits revêtus de poly-HEMA. Le contact direct peut entraîner la contamination du matériel collecté par du poly-HEMA, ce qui pourrait avoir un impact négatif sur la survie cellulaire.
3. Placez le(s) tube(s) de microcentrifugation de 1,5 mL dans un incubateur à 37 °C à 5 % de CO₂ pendant 30 min à 1 h pour permettre une digestion complète du gel matriciel par dispase.
4. Granulez les organoïdes par centrifugation à 800 x g pendant 5 min à RT et retirez le surnageant à l’aide d’une micropipette.
5. Ajoutez une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à la pastille organoïde et remettez-la en suspension en effleurant doucement.
   REMARQUE : Le fait de ne pas remettre suffisamment en suspension la pastille organoïde peut entraîner la contamination du matériel organoïde par une dispase résiduelle ou un gel matriciel.
6. Granulez les organoïdes par centrifugation à 800 x g pendant 5 min à RT et retirez le surnageant à l’aide d’une micropipette.
7. Gelez rapidement les granulés organoïdes en plaçant chaque tube dans une solution contenant de la glace sèche et du méthanol. Conservez le(s) tube(s) jusqu’à ce qu’il soit utilisé à -80 °C. Vous pouvez également extraire le lysat de protéines immédiatement après l’étape 1.6.
8. Remettre les granules organoïdes en suspension dans 100 μL de tampon de lyse des protéines (tableau 1) par 10 μL de volume cellulaire emballé. Effleurez pour le remettre en veilleuse.
   REMARQUE : Si vous reprenez après une congélation rapide, assurez-vous que le tampon de lyse des protéines est décongelé avant de prélever les échantillons à -80 °C, car le tampon de lyse doit être ajouté immédiatement aux échantillons pour empêcher l’activité de la phosphatase et de la protéase.
9. Incuber les échantillons dans un tampon de lyse protéique sur de la glace pendant au moins 45 min.
   REMARQUE : Il est recommandé de sonicer avant l’incubation sur glace pour augmenter l’efficacité de la récupération des protéines nucléaires ; Cependant, la sonication n’est pas nécessaire. Si la sonication n’est pas effectuée, passez à l’étape 1.10.
   1. Pour sonifier, immergez les tubes dans de la glace humide et appliquez doucement l’extrémité du démonteur sonique sur le tube de la microcentrifugeuse. Sonicate pendant 40 s à 20 kHz.
10. Procéder au transfert Western en suivant les protocoles établis.

Tableau 1 : Instructions pour la préparation des solutions clés

Recettes
Milieux contenant de la dispase	1 mg/mL de dispase + 10 μM d’inhibiteur de ROCK dans le DMEM F12 avancé. Stériliser le filtre à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
Milieux de dissociation	10 % FBS + 1x pénicilline-streptomycine dans RPMI 1640. Stériliser le filtre à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
Tampon de lyse des protéines	Tampon RIPA + inhibiteurs de la phosphatase + inhibiteurs de la protéase
Solution de blocage	10 % FBS en PBS avec 0,2 % Triton X-100

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
N° A83-01	Tocris	Référence 2939
DMEM/F-12 avancé	Thermo Fisher Scientific	12634010
Supplément de B-27 (50x), sans sérum	Thermo Fisher Scientific	17504044
Dispase II, Poudre	Thermo Fisher Scientific	Référence 17-105-041
Sérum fœtal bovin (FBS)	sigma	F8667
GlutaMAX Thermo	Fisher Scientific	35050061
Inhibiteur de la phosphatase Halt	Thermo Fisher Scientific	Référence 78428
Matrigel GFR Matrice membranaire	Corning CB-	40230C
N-acétyl-L-cystéine	sigma	A9165
Normocin	Thermo Fisher Scientific	ANT-NR-1
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/ mL)	Thermo Fisher Scientific	Tél. : 15-140-122
Poly(méthacrylate de 2-hydroxyéthyle) (Poly-HEMA)	sigma	Réf. P3932-25G
Essai de radio-immunoprécipitation (RIPA)	Thermo Fisher Scientific	PI89901
EGF humain recombinant, AnimalFree	PeproTech	AF-100-15
Noggin humain recombinant	PeproTech	120 à 10 °C
RPMI 1640 Medium, HEPES (cs of 10)	Thermo Fisher Scientific	22400105
Démantailleurs sonique	Thermo Fisher Scientific	FB120
Triton X-100	sigma	X100-5ML
Dichlorhydrate d’Y-27632 (inhibiteur de ROCK)	Selleck Chemical	S1049-50MG