Imagerie par immunofluorescence à monture entière : une technique de fixation et de coloration pour évaluer les organoïdes intacts

1. Fixation et coloration des organoïdes de la prostate pour l’analyse immunohistochimique par microscopie confocale à monture entière

1. Collecte d’organoïdes prostatiques à partir de plaques à 24 puits — CHRONOMÉTRAGE : 45-60 min
   REMARQUE : Lors de la collecte d’organoïdes de la prostate à traiter pour la microscopie confocale, il est essentiel de les manipuler avec soin afin de maintenir leur structure. Le protocole de collecte ci-dessous est conçu pour réduire la perturbation de la structure organoïde pendant l’isolement.
   1. Retirez le média de chaque puits de la plaque contenant des organoïdes en inclinant la plaque à un angle de 45°.
   2. Digérer le gel matriciel en l’incubant avec 500 μL de milieu contenant de la dispase (tableau 1) pendant 30 min dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂.
   3. Prélever la suspension organoïde digérée dans un tube de microcentrifugation et granuler les organoïdes par centrifugation à 800 x g pendant 3 min à RT. Retirer le surnageant.
2. Coloration immunofluorescente complète des organoïdes de la prostate — DURÉE : 3-4 jours (1-5 h/jour)
   1. Ajouter 500 μL de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS et incuber pendant 2 h à RT en agitant doucement.
   2. Granulez les organoïdes par centrifugation à 800 x g pendant 3 min à RT, retirez le surnageant et lavez le granulé avec 1 mL de PBS pendant 15 min en secouant doucement.
   3. Lavez la pastille comme à l’étape 1.2.2 deux fois de plus.
   4. Granuler les organoïdes par centrifugation à 800 x g pendant 3 min à RT et retirer le surnageant. Ajouter 1 μg/mL de DAPI dans une solution bloquante (tableau 1). Incuber pendant 2 h à RT ou toute la nuit à 4 °C en secouant doucement.
   5. Granuler les organoïdes par centrifugation à 800 x g pendant 3 min à RT et retirer le surnageant. Ajouter l’anticorps primaire (anti-p63 de lapin, anti-cytokératine 8 de souris) dans une solution bloquante et incuber toute la nuit à 4 °C en agitant doucement.
   6. Granuler les organoïdes par centrifugation à 800 x g pendant 3 min à RT et retirer le surnageant. Lavez la pastille avec 1 mL de PBS pendant 15 minutes en la secouant doucement.
   7. Lavez la pastille comme à l’étape 1.2.6 deux fois de plus.
   8. Granuler les organoïdes par centrifugation à 800 x g pendant 3 min à RT et retirer le surnageant. Ajouter l’anticorps secondaire (IgG-Alexa Fluor 594 anti-lapin de chèvre, IgG-Alexa Fluor 488 anti-souris de chèvre) dans une solution bloquante et incuber une nuit à 4 °C en agitant doucement.
   9. Granulez les organoïdes par centrifugation à 800 x g pendant 3 min à RT, retirez le surnageant et lavez le granulé avec 1 mL de PBS pendant 15 min en secouant doucement.
   10. Lavez le granulé comme à l’étape 1.2.9 deux fois de plus.

2. Nettoyage des tissus et montage des organoïdes de prostate colorés pour la microscopie confocale à montage entier — DURÉE : 7 H

1. Granuler les organoïdes par centrifugation à 800 x g pendant 3 min à RT et retirer le surnageant.
2. Ajouter 1 mL de saccharose à 30 % dans du PBS avec 1 % de Triton X-100 et incuber pendant 2 h à RT en agitant doucement.
3. Granuler les organoïdes par centrifugation à 800 x g pendant 3 min à RT et retirer le surnageant.
4. Ajouter 1 mL de saccharose à 45 % dans du PBS avec 1 % de Triton X-100 et incuber pendant 2 h à RT en secouant doucement.
5. Granuler les organoïdes par centrifugation à 800 x g pendant 3 min à RT et retirer le surnageant.
6. Ajouter 1 mL de saccharose à 60 % dans du PBS avec 1 % de Triton X-100 et incuber pendant 2 h à RT en agitant doucement.
7. Granuler les organoïdes par centrifugation à 800 x g pendant 3 min à RT et retirer 95 % du surnageant.
   REMARQUE : La pastille se détache à mesure que la concentration de saccharose augmente. Il est recommandé d’observer les organoïdes colorés au DAPI sous la lumière UV pour confirmer qu’ils n’ont pas été perdus lors de l’élimination du surnageant.
8. Transférez une gouttelette de 10 à 20 μL de la suspension restante dans une lamelle de protection à chambre et passez à la microscopie confocale.
   REMARQUE : Des fragments de lamelles peuvent être placés de chaque côté de la gouttelette pour être utilisés comme entretoises (Figure 1C). Ceux-ci empêchent les organoïdes de s’effondrer lorsqu’une lamelle est placée sur la gouttelette.

Tableau 1 : Instructions pour la préparation des solutions clés

Figure 1 : Analyse de l’expression des marqueurs de lignée dans les organoïdes de la prostate par Western blot et microscopie confocale à monture entière.(A) Images représentatives en contraste de phase d’organoïdes dérivés basaux (en haut) et luminaux (en bas) après 7 jours de culture. Barre d’échelle = 100 μm. (B) Analyse par transfert Western d’organoïdes dérivés basaux (Bas) et luminaux (Lum) après 5 jours de culture. Coloration du marqueur basal, la cytokératine 5 (K5), et du marqueur luminal, la cytokératine 8 (K8), et d’un contrôle de charge, l’histone H3 (HH3). (C) Schéma illustrant une lamelle de recouvrement chambrée avec des entretoises. (D) Images représentatives par contraste interférentiel différentiel (CID) et immunofluorescentes d’organoïdes dérivés basaux (en haut) et luminaux (en bas) après 7 jours de culture. Coloration pour p63 (rouge), K8 (vert) et DAPI (bleu) individuellement et fusionnée. Barres d’échelle = 100 μm.