Isolement de cellules cibles à base de fil fonctionnalisé : une technique ex vivo pour isoler des cellules cancéreuses à partir de sang périphérique enrichi

Résumé

Source : Chen S. et al. Pré-enrichissement de cellules cibles et amplification du génome entier pour la caractérisation en aval de la cellule unique. J. Vis. Exp. (2018)

Dans cette vidéo, nous démontrons l’isolement de cellules cancéreuses épithéliales exprimant EpCAM à partir d’échantillons de sang périphérique. La technique implique l’utilisation d’un fil de qualité médicale fonctionnalisé avec des anticorps EpCAM pour capturer les cellules cibles. Les cellules capturées sont ensuite extraites dans une solution tampon

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Protocole

REMARQUE : Ce protocole décrit l’isolement des cellules HT-29 (lignée cellulaire du cancer du côlon humain) à partir de PBS ou de mélanges artificiels de cellules HT-29 et de sang périphérique. La même expérience a été réalisée avec deux lignées cellulaires supplémentaires (LNCaP et VCaP) et peut théoriquement être réalisée avec toutes les cellules exprimant EpCAM.

1. Préparation des cellules cibles

1. Culture cellulaire et marquage des cellules
   note: Dans ce protocole, les cellules sont cultivées dans des flacons de culture de 75 cm². Veuillez ajuster les quantités de réactifs en conséquence si d’autres dispositifs de culture cellulaire sont utilisés (par exemple, des boîtes de culture de 25 cm², des plaques à 6 puits, etc.). Tous les liquides utilisés sont préchauffés à 37 °C dans un bain-marie. Sauf indication contraire, toutes les étapes du protocole sont effectuées à température ambiante (RT).
   1. Cultivez des cellules HT-29 dans le milieu modifié McCoy's 5a avec 2 mM de L-glutamine, 20 mM de Hepes, 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO₂.
   2. Lorsque les cellules sont confluentes à 90 %, retirez le milieu et rincez les cellules avec 10 ml de 1x PBS.
   3. Pour récolter les cellules, ajoutez 2 mL de la solution de détachement cellulaire (Table des matériaux et des réactifs) aux cellules et incubez les cellules pendant environ 5 min à 37 °C.
      note: La solution de détachement contient des enzymes protéolytiques et collagénolytiques dans 1x PBS, 0,5 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et 3 mg/L de rouge de phénol. Réduire au minimum le temps de préchauffage de la solution de détachement de cellules, car celle-ci sera inactive après 1 h à 37 °C. Couvrir toute la couche cellulaire pour obtenir un détachement optimal des cellules.
   4. Vérifiez le détachement des cellules à l’aide d’un microscope inversé.
   5. Transférez toutes les cellules détachées dans un tube de 50 mL prérempli de 10 mL de milieu de culture cellulaire (le même que celui utilisé à l’étape 1.1.1.) et remettez les cellules en suspension par pipetage.
   6. Placez la suspension cellulaire restante sur un mélangeur à rouleaux horizontal à RT et passez à l’étape d’étiquetage.
2. Marquage de cellules cibles sur des cellules vivantes
   1. Diluer 1 μL de 5 mM de CFSE (fourni en diméthylsulfoxyde de méthyle, DMSO) dans 1 mL de 1x PBS préchauffé à 37 °C pour obtenir la solution d’étiquetage CFSE prête à l’emploi de 5 μM.
      note: Pour des résultats de coloration optimaux, utilisez des solutions fraîchement préparées.
   2. Préparez une solution de coloration de l’ADN prête à l’emploi (Table des matériaux et des réactifs) dans 1x PBS et stockez-la à une température de 2 à 6 °C à l’abri de la lumière.
      note: Pour des résultats de coloration optimaux, utilisez des solutions fraîchement préparées.
   3. Sortez les cellules du mélangeur à rouleaux horizontal (étape 1.1.6.) et granulez les cellules à 300 x g pendant 10 min. Retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 10 ml de 1x PBS.
   4. Rincez à nouveau les cellules avec 1x PBS et remettez en suspension la pastille de cellule dans une solution de marquage CFSE prête à l’emploi de 500 μL.
   5. Incuber les cellules à 37 °C pendant 15 min et recueillir les cellules après centrifugation à 300 x g pendant 3 min.
   6. Remettre en suspension les cellules marquées dans 1 mL de milieu de culture cellulaire préchauffé et laisser les cellules se régénérer à 37 °C pendant 30 min.
   7. Récoltez les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 3 min et remettez en suspension les pastilles cellulaires dans 1 mL de solution de coloration de l’ADN prête à l’emploi à 37 °C pendant 10 min.
   8. Granulez les cellules, retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 4 mL de 1x PBS. Évaluez la densité cellulaire à l'aide d'un hémocytomètre et vérifiez le marquage par fluorescence à l'aide d'un microscope à fluorescence équipé de filtres 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et d'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (figures 1A et 1E).
   9. Centrifugez les cellules à 300 x g pendant 3 minutes et remettez en suspension la pastille cellulaire en fonction des densités cellulaires nécessaires à l’expérience respective, comme indiqué dans la section suivante, et placez-la sur de la glace.

2. Charger le fil

REMARQUE : Les cellules peuvent être isolées à partir de pics de cellules cibles/de sang périphérique à l’échelle du millilitre ou en fournissant un petit nombre de cellules à l’échelle du microlitre. Alors que la première approche permet d’imiter des conditions de cellules rares dans le sang périphérique, la seconde peut être le moyen préféré de fixer quelques cellules à des fins d’optimisation / de test de protocole.

1. Chargement du fil à l’aide d’un grand volume de suspensions de cellules
   1. Préparez une solution bloquante de BSA à 2 % en dissolvant 0,8 g de BSA dans 40 mL de 1x PBS (utilisation en culture cellulaire). Dissoudre la BSA par tourbillonnage initial et incubation ultérieure à RT sur un mélangeur à rouleaux horizontal pendant 10 à 20 min.
   2. Rincer les tubes d’EDTA ou d’héparine de sodium vides avec 2 ml de BSA à 2 % pour éliminer les résidus d’anticoagulant et jeter la solution. Bloquer la surface du tube par incubation à RT avec 5 mL de BSA à 2 % sur un mélangeur à rouleaux horizontal à 15 tr/min pendant 30 min et jeter la solution.
   3. Diluez les cellules marquées (section 1.2.) à une densité de 100 000 cellules/ml et utilisez 5 ml pour charger le fil.
   4. Ajouter 5 ml de la suspension cellulaire étiquetée (500 000 cellules au total) dans le tube. Évitez les bulles lors de l’ajout de la suspension cellulaire.
   5. Retirez le fil du compartiment de rangement ainsi que le capuchon en caoutchouc qui le maintient et rincez-le dans 1 PBS (Figure 2).
   6. Pénétrez le capuchon du tube en caoutchouc du tube EDTA (étape 2.1.4.) à l’aide d’une aiguille de seringue (20 G) et insérez le fil de manière à ce que la partie fonctionnelle soit complètement immergée dans la suspension de la cellule lorsque le capuchon est de retour sur le tube et que le tube est placé sur le mélangeur à rouleaux inclinés.
      note: La partie fonctionnelle à triple hélice du fil doit être recouverte d’une suspension de cellule tout au long de la charge.
   7. Faites pivoter les tubes sur un mélangeur à rouleaux incliné à 5 tr/min pendant 30 min pour permettre aux cellules de se fixer au fil.
   8. Rincez le fil avec 5 mL de PBS et rangez-le dans l’obscurité à 2-6 °C dans un tube de 15 mL contenant 1x PBS jusqu’à l’examen visuel.
      note: La partie fonctionnelle du fil doit toujours être immergée dans du PBS pour éviter d’endommager les cellules.
2. Isolement de cellules cibles à partir de mélanges artificiels avec du sang périphérique (méthode de charge alternative à : 2.1. Charge du fil à l’aide d’un grand volume de suspensions de cellules)
   1. Diluer les cellules marquées (section 1.2.) pour obtenir des suspensions cellulaires à haute densité cellulaire (> 1 000 000 cellules/mL), maintenant ainsi le volume de suspension cellulaire ajouté au sang périphérique faible.
   2. Ajoutez 500 à 500 000 cellules à 5 ml de sang périphérique et mélangez-les en inversant le tube.
   3. Retirez le fil du compartiment de rangement, retirez le capuchon en caoutchouc qui maintient le fil et rincez-le dans 1x PBS.
   4. Pénétrez un nouveau capuchon de tube avec la partie non fonctionnelle de l’appareil à l’aide d’une aiguille de seringue (20 G) de sorte que la partie fonctionnelle soit complètement immergée dans le sang dopé lorsque le capuchon est de nouveau sur le tube et que le tube est placé sur le mélangeur à rouleaux incliné.
      note: La partie fonctionnelle à triple hélice du fil doit être recouverte d’une suspension de cellule tout au long de la charge.
   5. Incuber le tube sur le mélangeur à rouleaux inclinés à 5 tr/min pendant 30 min à RT.
   6. Rincez le fil trois fois dans 1x PBS et rangez-le dans l’obscurité dans un tube de 15 mL contenant 1x PBS jusqu’à l’examen visuel.
      note: La partie fonctionnelle du fil doit toujours être immergée pour éviter d’endommager les cellules.
3. Charge du fil à partir de suspensions de cellules de faible volume (méthode de charge alternative à : 2.1. Charge du fil à l’aide d’un grand volume de suspensions de cellules)
   1. Remettre en suspension les cellules marquées à 1 000 000 cellules/mL dans 1x PBS.
   2. Fixez une pipette Pasteur jetable en verre de 150 mm à l’horizontale sur un support.
   3. Retirez le fil du compartiment de rangement, mais gardez le capuchon en caoutchouc jaune qui maintient le fil.
   4. Placez le fil dans la pipette de manière à ce que la partie fonctionnalisée soit située dans l’extrémité de la pipette Pasteur sans toucher le verre.
      note: L’extrémité du fil ne doit pas dépasser de l’extrémité de la pipette Pasteur. Évitez de boucher l’extrémité arrière de l’embout de la pipette Pasteur avec le capuchon en caoutchouc qui maintient le fil. S’ils sont bien fixés, les suspensions de cellules ne peuvent pas être chargées de l’autre côté dans la pointe de la pipette.
   5. Chargez 15 μL de suspension cellulaire dans l’extrémité de la pipette Pasteur recouvrant la partie fonctionnalisée du fil.
   6. Incuber le fil pendant 10 min. Tourner manuellement d’un quart de fois le fil/l’embout de pipette Pasteur assemblé toutes les minutes.
   7. Retirez le fil de l’embout de la pipette Pasteur, rincez-le dans 5 mL de 1x PBS et rangez-le dans l’obscurité à 2-6 °C dans un tube de 15 mL contenant 1x PBS jusqu’à l’examen visuel.
      note: La partie fonctionnelle doit toujours être immergée dans 1x PBS pour éviter d’endommager les cellules.

3. Comptage des cellules sur le fil

REMARQUE : Gardez toujours la partie fonctionnelle du fil immergée dans 1x PBS pour éviter d’endommager les cellules.

1. À l’aide d’un stylo à graisse, dessinez une zone rectangulaire sur une lame de verre et ajoutez 500 μL de 1x PBS.
2. Pliez la partie non fonctionnelle du fil et placez-la sur la lame de verre de sorte que la partie fonctionnelle soit immergée dans 1x PBS.
   note: Ajustez la surface du rectangle et le volume de 1x PBS pour couvrir complètement la partie fonctionnelle du fil. Utilisez un ruban adhésif double face pour monter la partie non fonctionnelle du fil sur la glissière.
3. Inspectez visuellement les deux côtés du fil pour énumérer les cellules capturées (Figure 1B et 1F).
   note: La présence de cellules est déterminée à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé de filtres pour DAPI et FITC. Les deux côtés du fil peuvent être inspectés et le nombre de cellules peut être évalué (pour un nombre élevé de cellules) ou compté (uniquement possible si un petit nombre de cellules est attaché au fil). Cette étape peut être ignorée si l’énumération des cellules n’est pas nécessaire.
4. Après le balayage, replacez le fil dans le tube de 15 mL contenant le 1x PBS, stockez le fil dans l’obscurité.
   note: La plupart des parties non fonctionnelles du fil peuvent être coupées (y compris le coude) et retirées, ce qui facilite le stockage.

4. Détachement et récupération des cellules cibles

REMARQUE : Le détachement des cellules doit se faire dans les 4 h suivant l’isolement.

1. Dissoudre 4 mg du composant du tampon de libération (Table des matériaux et des réactifs) par mL de 1x PBS et filtrer la solution à travers un filtre stérile de 0,2 μm pour obtenir le tampon prêt à l’emploi.
   note: Le polymère du fil est composé d’un hydrogel qui est fonctionnalisé avec des anticorps anti-EpCAM permettant de se lier aux cellules cibles présentatrices d’EpCAM. Le tampon de libération contient une enzyme protéolytique carbone-oxygène capable de cliver l’hydrogel. Le clivage protéolytique entraîne la dégradation du polymère et donc le détachement des cellules capturées.
2. Préchauffez le tampon de démoulage à 37 °C pendant 5 min.
3. Ajouter 1,6 mL de tampon de démoulage pour remplir un tube de réaction de 1,5 mL.
   note: Les tubes conçus pour des volumes de réaction de 1,5 mL permettent l’application de 1,6 mL qui est nécessaire pour immerger la partie fonctionnelle du fil.
4. Incuber la partie fonctionnelle du fil dans le tampon de démoulage à 37 °C (bain-marie) pendant 20 min. Utilisez le capuchon en caoutchouc livré avec le fil au lieu du capuchon du tube pour fixer le fil dans le tube de 1,5 mL afin d’éviter la contamination pendant l’incubation dans le bain-marie.
5. Transférez l’ensemble fil/tube dans un agitateur à RT et 500 tr/min pendant 15 min.
   note: Le shaker a une orbite de 1,5 mm.
6. Placez l’ensemble fil/tube dans une centrifugeuse et faites-le tourner à 300 x g pendant 10 min.
7. Retirez le fil du tube, fermez le capuchon et centrifugez à nouveau le tube à 300 x g pendant 10 min
   note: Le fil peut être stocké dans 1x PBS à 2-6 °C dans l’obscurité pour le comptage des cellules afin d’évaluer l’efficacité du détachement/vérifier les cellules restantes sur le fil.
8. Pour réduire le volume de la suspension cellulaire, prélever tout le surnageant sauf 100 μL (micromanipulation) ou 300 μL (cytocentrifugation et microdissection laser ultérieure) et procéder immédiatement à l’échantillonnage sur cellule unique.

Résultats

Figure 1 : Visualisation des cellules étiquetées.(A,E) Cellules avant charge : Les cellules sont marquées avec CFSE et contre-colorées avec un colorant d’intercalation d’ADN montrant une gamme d’intensité de signal CFSE (vert). (B,F) Cellules marquées capturées sur le fil. (C,G) Fil après la p...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tampon de libération Gilupi	Gilupi	GIL083	Utilisé pour détacher les cellules du fil
McCoy's 5A Medium (1x) suppl. avec L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	Référence 16600-082	Milieu de culture utilisé pour les cellules HT-29, adapter le milieu de culture à la lignée cellulaire utilisée pour les expériences
Solution tampon HEPES (1 m)	L’AAP	S11-001	Supplément pour McCoy's 5A Medium
Sérum fœtal bovin Gold	L’AAP	Réf. A15-151	Supplément pour le médium modifié McCoy's 5a
Pénicilline-streptomycine (100x)	Biowest	N° L0018-100	Supplément pour le médium modifié McCoy's 5a
Saline tamponnée au phosphate (1x PBS)	Thermo Fisher Scientific	Référence 10010-015
Accutase	Biowest	N° L0950-100	Solution de décollement cellulaire (culture cellulaire)
Bain-marie	GFL	Imprimante Type 1003	Utilisé pour les solutions de préchauffage
incubateur	Thermo Fisher Scientific		Utilisé pour l’incubation des cellules (culture cellulaire)
Tubes de réaction de 50 mL	VWR	Référence 525-0403
Pétrin à rouleaux	Stuart Scientific	SRT6D	Utilisé pour fixer les cellules au fil tout en empêchant les cellules de sédimenter
Kit de prolifération cellulaire CellTrace CFSE	Thermo Fisher Scientific	Réf. C34554	Utilisé pour le marquage de cellules vivantes (marquage cytoplasmique)
Hoechst 33342	N° H3570	Thermo Fisher Scientific	Utilisé pour colorer l’ADN (contre-coloration nucléique)
Centrifugeuse (équipée pour contenir des tubes de réaction de 15 mL et 50 mL)	Thermo Fisher Scientific	Heraeus Megafuge 40R	Utilisé pour les cellules de granulation
Observer Z1 (microscope à fluorescence/microdissection laser)	Microimagerie Carl Zeiss		Microscope inversé (immunofluorescence) capable de microdissection laser ; Les microscopes à fluorescence doivent être capables de détecter Hoechst 33342 (filtre DAPI) et CFSE (filtre FITC)
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503-50G	Utilisé pour le revêtement de surfaces en verre/plastique
Mini-shaker MS1	Sigma-Aldrich	Z404039	Utilisé pour le vortex
Tubes Vacutainer EDTA (ou Na-héparine)	Bd	366450 (ou 366480)	Utilisé comme tube de réaction pour la capture ex vivo de cellules cibles
Detektor CANCER03 DC03	Gilupi	GIL003	Fil fonctionnalisé capable d’isoler et de détacher des cellules positives à l’EpCAM (également appelé catch & release, C&R)
Aiguilles de seringue (G20)	VWR	Référence 613-0554	Utilisé pour percer les capuchons en caoutchouc afin de permettre à la partie non fonctionnelle du C&R de passer à travers celui-ci
Chambre Neubauer	Roth	Réf. T729.1	Utilisé pour compter les cellules
Pipettes Pasteur 150 mm	Volac	D810	Utilisé pour l’application à faible volume de cellules au C&R
Stylo à graisse	Dako	S2002	Utilisé sur des lames de verre pour maintenir la suspension des cellules en place
Filtre à seringue stérile (0,2 μm)	Corning	431219	Pour filtrer le tampon de libération Gilupi fraîchement préparé
Delfia PlateShaker	Perkin Elmer	Référence 1296-003	Utilisé pour l’agitation lors du détachement de cellules
Tubes de 1,5 mL	Eppendorf	30 125 150
Kit WGA Ampli1	Biosystèmes de silicium		À commander via Silicon Biosystems
Axiovert M200 équipé d’un Mikromanipulator MMJ et d’un vario CellTram	Zeiss/Eppendorf		Utilisez la micromanipulation à portée de main
Microcapillaires (25 μm de diamètre), CustomTip Type I	Eppendorf	930001201	Utilisé pour la micromanipulation des cellules
Tubes PCR de 0,2 mL	Biozym	Référence 710920
Cytocentrifugeuse et équipement	Hettich	Universel 32	Utilisez la cytocentrifugeuse à portée de main
Thermocycleur	Bio-Rad	Dyade de moteur d’ADN	Chaque thermocycleur avec couvercle chauffant peut être utilisé
Microcentrifugeuse	Roth	CX73.1	Utilisez une centrifugeuse de bureau à portée de main
MembraneSlide 1.0 PET	Zeiss	Tél. : 415101-4401-050	Lames de verre recouvertes d’une membrane utilisées pour la microdissection laser