Échantillonnage de cellules uniques par micromanipulation : une technique pour isoler des cellules uniques à partir d’une suspension de cellules cancéreuses

Abstract

Source : Chen S. et al. Pré-enrichissement de cellules cibles et amplification du génome entier pour la caractérisation en aval de la cellule unique. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo décrit la technique permettant d’isoler des cellules uniques d’un pool de cellules cibles pour effectuer une analyse en aval. Dans cette méthode, un micromanipulateur monté sur un microscope est utilisé pour l’isolement de haute précision d’une seule cellule cible.

Protocol

1. Échantillonnage de cellule unique

1. Micromanipulation
   REMARQUE : Pour permettre des applications en aval telles que l’analyse du génome entier (WGA), des cellules uniques isolées seront ajoutées à 2 μL de mélange maître de lyse cellulaire. Préparez un master mix en fonction du nombre de cellules à traiter. Calculez les volumes supplémentaires pour les pertes dues au pipetage et placez le mélange maître de lyse cellulaire sur de la glace.
   1. Préparer le mélange maître de lyse cellulaire (composants du kit WGA, de la table des matériaux et des réactifs). Mélanger brièvement 2,0 μL de tampon réactionnel, 1,3 μL d’octylphénoxypolyéthoxyéthanol (solution à 10 %), 1,3 μL de 4-(1,1,3,3-tétraméthylbutyl)phényl-polyéthylène glycol (solution à 10 %), 2,6 μL d’une solution de protéinase K et 12,8 μL d’eau exempte de RNase/DNase pour obtenir un mélange maître pour 10 échantillons (volume total de 20 μL).
      note: Pour plus d’échantillons, augmentez les volumes en conséquence.      
   2. À l’aide d’un stylo à graisse, dessinez une zone qui maintient la suspension de la cellule en place. Ajustez la surface et le volume si la densité de la cellule est trop élevée (c’est-à-dire marquez une plus grande zone sur la lame de verre, chargez 1x PBS et une aliquote de la suspension de la cellule).
   3. Pipetez toute la suspension de la cellule cible sur la lame de verre.
   4. Transférez la lame de verre dans un microscope équipé d’un micromanipulateur. Laissez les cellules se déstabiliser pendant 5 min.
   5. Préparez des tubes PCR de 0,2 mL chargés de 2,0 μL de mélange maître de lyse cellulaire (préparé à l’étape 1.1.1.) et conservez-les sur de la glace.
   6. Prélever des cellules individuelles dans 1 μL de 1x PBS à l’aide du micromanipulateur et transférer les cellules dans un tube contenant le mélange maître de lyse cellulaire.
      note: Pour transférer des cellules micromanipulées dans le tampon de lyse cellulaire, placez le capillaire directement dans les 2 μL de solution de lyse et éjectez-le jusqu’à ce que des bulles soient visibles.
   7. Faites tourner brièvement l’échantillon à 2000 x g pendant 3 s à l’aide d’un microfuge de bureau pour recueillir tout le liquide au fond du tube. Placez les échantillons sur de la glace.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saline tamponnée au phosphate (1x PBS)	Thermo Fisher Scientific	Référence 10010-015
Tubes Vacutainer EDTA (ou Na-héparine)	Bd	366450 (ou 366480)	Utilisé comme tube de réaction pour la capture ex vivo de cellules cibles
Pipettes Pasteur 150 mm	Volac	D810	Utilisé pour l’application à faible volume de cellules au C&R
Stylo à graisse	Dako	S2002	Utilisé sur des lames de verre pour maintenir la suspension des cellules en place
Axiovert M200 équipé d’un Mikromanipulator MMJ et d’un vario CellTram	Zeiss/Eppendorf		Utilisez la micromanipulation à portée de main
Microcapillaires (25 μm de diamètre), CustomTip Type I	Eppendorf	930001201	Utilisé pour la micromanipulation des cellules
Tubes PCR de 0,2 mL	Biozym	Référence 710920