Échantillonnage de cellules uniques à l’aide de la microdissection par capture laser : une technique pour récolter des cellules cibles d’une population cellulaire hétérogène

1. Échantillonnage de cellule unique

1. Microdissection laser
   REMARQUE : Des cellules individuelles seront ajoutées à 4,5 μL de mélange maître de lyse cellulaire (composants du kit WGA, Table des matériaux et des réactifs) pour WGA.
   1. Préparez le mélange maître de lyse cellulaire selon Czyż et al. en mélangeant 5,0 μL de tampon de réaction, 1,3 μL d’octylphénoxypolyéthoxyéthanol (solution à 10 %), 1,3 μL de 4-(1,1,3,3-tétraméthylbutyl)phényl-polyéthylène glycol (solution à 10 %), respectivement, 2,6 μL d’une solution de protéinase K et 34,8 μL d’eau exempte de RNase/DNase pour obtenir un mélange maître pour 10 échantillons (volume total de 45 μL). Placez le mélange principal sur ice.
      note: Pour plus d’échantillons, augmentez les volumes en conséquence.
   2. Traiter aux UV les lames recouvertes d’une membrane adaptée à la microdissection laser. Placez les lames dans un appareil de réticulation de l’ADN et exposez-les aux UV les plus élevés pendant environ 10 minutes.
   3. Assemblez la lame revêtue de membrane dans une cytocentrifugeuse et cytospinnez l’ensemble de la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min
      note: Lors de l’utilisation d’un système inliquide, où les cellules sont cytocentrifugées sur la solution à glissière, retirer le surnageant après cytocentrifugation et appliquer un essorage sec à 1140 x g pendant 1 min.
   4. Procéder directement à la microdissection au laser ou laisser sécher les cytospins à l’air libre pendant la nuit et congeler les échantillons à -20 °C pour un stockage à long terme.
   5. Pipetez 4,5 μL de mélange maître de lyse cellulaire dans le capuchon d’un tube PCR de 0,2 mL et prélevez des cellules individuelles au moyen d’une microdissection laser.
   6. Récupérez le tube PCR du microscope de microdissection laser et fermez le tube. Recueillir tout le liquide au fond du tube par rotation courte et placer l’échantillon sur de la glace.
   7. Procéder à l’utilisation d’un WGA à cellule unique ou stocker les échantillons isolés à -80 °C jusqu’à 1 mois avant de poursuivre le traitement.