Échantillonnage de cellules uniques à l’aide de la microdissection par capture laser : une technique pour récolter des cellules cibles d’une population cellulaire hétérogène

Abstract

Source : Chen S. et al. Pré-enrichissement de cellules cibles et amplification du génome entier pour la caractérisation en aval de la cellule unique. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo décrit la technique d’obtention d’une cellule unique à partir d’une population cellulaire hétérogène à l’aide de la microdissection par capture laser. La cellule isolée peut être utilisée pour d’autres études génomiques ou des recherches sur le cancer.

Protocol

1. Échantillonnage de cellule unique

1. Microdissection laser
   REMARQUE : Des cellules individuelles seront ajoutées à 4,5 μL de mélange maître de lyse cellulaire (composants du kit WGA, Table des matériaux et des réactifs) pour WGA.
   1. Préparez le mélange maître de lyse cellulaire selon Czyż et al. en mélangeant 5,0 μL de tampon de réaction, 1,3 μL d’octylphénoxypolyéthoxyéthanol (solution à 10 %), 1,3 μL de 4-(1,1,3,3-tétraméthylbutyl)phényl-polyéthylène glycol (solution à 10 %), respectivement, 2,6 μL d’une solution de protéinase K et 34,8 μL d’eau exempte de RNase/DNase pour obtenir un mélange maître pour 10 échantillons (volume total de 45 μL). Placez le mélange principal sur ice.
      note: Pour plus d’échantillons, augmentez les volumes en conséquence.
   2. Traiter aux UV les lames recouvertes d’une membrane adaptée à la microdissection laser. Placez les lames dans un appareil de réticulation de l’ADN et exposez-les aux UV les plus élevés pendant environ 10 minutes.
   3. Assemblez la lame revêtue de membrane dans une cytocentrifugeuse et cytospinnez l’ensemble de la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min
      note: Lors de l’utilisation d’un système inliquide, où les cellules sont cytocentrifugées sur la solution à glissière, retirer le surnageant après cytocentrifugation et appliquer un essorage sec à 1140 x g pendant 1 min.
   4. Procéder directement à la microdissection au laser ou laisser sécher les cytospins à l’air libre pendant la nuit et congeler les échantillons à -20 °C pour un stockage à long terme.
   5. Pipetez 4,5 μL de mélange maître de lyse cellulaire dans le capuchon d’un tube PCR de 0,2 mL et prélevez des cellules individuelles au moyen d’une microdissection laser.
   6. Récupérez le tube PCR du microscope de microdissection laser et fermez le tube. Recueillir tout le liquide au fond du tube par rotation courte et placer l’échantillon sur de la glace.
   7. Procéder à l’utilisation d’un WGA à cellule unique ou stocker les échantillons isolés à -80 °C jusqu’à 1 mois avant de poursuivre le traitement.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
McCoy's 5A Medium (1x) suppl. avec L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	Référence 16600-082	Milieu de culture utilisé pour les cellules HT-29, adapter le milieu de culture à la lignée cellulaire utilisée pour les expériences
Solution tampon HEPES (1 m)	L’AAP	S11-001	Supplément pour McCoy's 5A Medium
Sérum de bovin fœtal Gold	L’AAP	Réf. A15-151	Supplément pour le médium modifié McCoy's 5a
Pénicilline-streptomycine (100x)	Biowest	N° L0018-100	Supplément pour le médium modifié McCoy's 5a
Saline tamponnée au phosphate (1x PBS)	Thermo Fisher Scientific	Référence 10010-015
Accutase	Biowest	N° L0950-100	Solution de décollement cellulaire (culture cellulaire)
Bain-marie	GFL	Imprimante Type 1003	Utilisé pour les solutions de préchauffage
incubateur	Thermo Fisher Scientific		Utilisé pour l’incubation des cellules (culture cellulaire)
Tubes de réaction de 50 mL	VWR	Référence 525-0403
Pétrin à rouleaux	Stuart Scientific	SRT6D	Utilisé pour fixer les cellules au fil tout en empêchant les cellules de sédimenter
Kit de prolifération cellulaire CellTrace CFSE	Thermo Fisher Scientific	Réf. C34554	Utilisé pour le marquage de cellules vivantes (marquage cytoplasmique)
Hoechst 33342	N° H3570	Thermo Fisher Scientific	Utilisé pour colorer l’ADN (contre-coloration nucléique)
Centrifugeuse (équipée pour contenir des tubes de réaction de 15 mL et 50 mL)	Thermo Fisher Scientific	Heraeus Megafuge 40R	Utilisé pour les cellules de granulation
Observer Z1 (microscope à fluorescence/microdissection laser)	Microimagerie Carl Zeiss		Microscope inversé (immunofluorescence) capable de microdissection laser ; Les microscopes à fluorescence doivent être capables de détecter Hoechst 33342 (filtre DAPI) et CFSE (filtre FITC)
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503-50G	Utilisé pour le revêtement de surfaces en verre/plastique
Mini-shaker MS1	Sigma-Aldrich	Z404039	Utilisé pour le vortex
Detektor CANCER03 DC03	Gilupi	GIL003	Fil fonctionnalisé capable d’isoler et de détacher les cellules EpCAMpositive (également appelé catch&release, C&R)
Aiguilles de seringue (G20)	VWR	Référence 613-0554	Utilisé pour percer les capuchons en caoutchouc afin de permettre à la partie non fonctionnelle du C&R de passer à travers celui-ci
Chambre Neubauer	Roth	Réf. T729.1	Utilisé pour compter les cellules
Pipettes Pasteur 150 mm	Volac	D810	Utilisé pour l’application à faible volume de cellules au C&R
Stylo à graisse	Dako	S2002	Utilisé sur des lames de verre pour maintenir la suspension des cellules en place
Delfia PlateShaker	Perkin Elmer	Référence 1296-003	Utilisé pour l’agitation lors du détachement de cellules
Tubes de 1,5 mL	Eppendorf	30 125 150
Kit WGA Ampli1	Biosystèmes de silicium		À commander via Silicon Biosystems
Tubes PCR de 0,2 mL	Biozym	Référence 710920
Cytocentrifugeuse et équipement	Hettich	Universel 32	Utilisez la cytocentrifugeuse à portée de main
Thermocycleur	Bio-Rad	Dyade de moteur d’ADN	Chaque thermocycleur avec couvercle chauffant peut être utilisé
Microcentrifugeuse	Roth	CX73.1	Utilisez une centrifugeuse de bureau à portée de main
UV Stratalinker 1800	Stratagène	400072	Utilisez l’agent de réticulation de l’ADN à portée de main