Injection intraprostatique de cellules cancéreuses : une technique d’administration de cellules cancéreuses pour établir un modèle murin de cancer de la prostate orthotopique

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation préopératoire de la souris

REMARQUE : Abriter les souris dans l’animalerie de l’université pendant au moins une semaine avant l’opération pour permettre une adaptation adéquate et minimiser le stress de l’animal. Les étapes 1.1 à 1.6 sont effectuées par l’assistant du chirurgien. Toutes les étapes chirurgicales ultérieures sont effectuées par le chirurgien à l’aide de gants stériles et d’outils chirurgicaux avec une technique stérile.

1. Anesthésier les souris avec de l’isoflurane (2-5 % pour l’induction via la chambre, 1-3 % pour l’entretien via le cône nasal). Vérifier l’induction complète par la perte du réflexe de pincement de l’orteil.
2. Pesez les souris et administrez-leur au moins 0,05 mg/kg de l’analgésique buprénorphine s.c.
   note: Le poids de la souris ≥20 g est idéal pour des injections intraprostatiques réussies.
3. Appliquez la lubrification de la pommade ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir le dessèchement de la cornée.
4. Rasez toute la fourrure de l’abdomen.
5. Stérilisez l’abdomen en trois cycles d’application circulaire de gommage chirurgical à l’aide de tampons stériles non adhérents suivis de lingettes imbibées d’alcool stériles. Laisser sécher l’abdomen.
   note: Pour le reste de l’intervention chirurgicale, seuls des gants stériles et des instruments chirurgicaux doivent être utilisés pour entrer en contact avec l’abdomen de souris stérilisé.
6. Transférez la souris en décubitus dorsal sur une surface propre sur un coussin chauffant directement sous l’objectif d’un microscope chirurgical propre.
7. Couvrez la souris avec un rideau stérile avec un petit trou découpé sur l’abdomen.

2. Injection intra-prostatique

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes chirurgicales dans des conditions stériles. Le réglage du microscope, du placement de la souris ou de tout autre objet non stérile doit être effectué avec une aide supplémentaire.

1. Effectuez une incision d’environ 1 cm de la peau externe le long de la ligne médiane de l’abdomen au-dessus du pénis et des glandes préputiales (Figure 1D).
2. Séparez le tissu conjonctif entre la peau abdominale externe et la musculature abdominale interne en ouvrant les ciseaux entre les couches.
3. Effectuez une incision similaire sur les muscles abdominaux internes, à l’aide d’une pince pour soulever les muscles afin d’éviter de perforer les intestins ou la vessie (Figure 1D).
4. Localisez l’une des vésicules séminales bilatérales (Figure 1A, blanche)/lobes antérieurs de la prostate (Figure 1A, noir), qui sont souvent postérieurs, latéraux et légèrement supérieurs à la vessie (Figure 1A, jaune), mais cela peut varier d’une souris à l’autre. Les lobes antérieurs de la prostate sont translucides et attachés à la moindre courbure des vésicules séminales blanches.
5. Soulevez doucement l’extrémité de la vésicule séminale à l’aide de la pince à tissu Graefe pour créer une tension sur le tissu sans perforer la vésicule séminale (Figure 1E).
6. Mélangez la solution de matrigel Myc-CaP par pipetage gentile (effectué par l’assistant chirurgien), car les cellules peuvent avoir été granulées, et aspirez lentement 30 μL (1x10⁶ cellules) dans l’aiguille pour éviter les bulles d’air.
7. Insérez soigneusement le biseau de l’aiguille parallèlement à l’axe long du lobe antérieur de la prostate. Injectez lentement 30 μL dans le lobe, puis rétractez lentement l’aiguille pour éviter les fuites (figure 1F). Vérifier l’injection adéquate par engorgement du lobe antérieur de la prostate (Figure 1G).
8. Tenez soigneusement la vésicule séminale et le lobe de la prostate à l’extérieur de la souris pendant environ 30 secondes pour permettre au matrigel de se solidifier partiellement à l’intérieur du lobe. Pendant ce temps, collectez toute fuite de solution cellulaire dans l’abdomen à l’aide d’un applicateur stérile à embout en polyester pour empêcher le développement de tumeurs non orthotopiques sans appuyer sur le lobe de la prostate injecté.
9. Remettez soigneusement la vésicule séminale et le lobe de la prostate injecté dans l’abdomen sans exercer de pression sur le lobe. Remplacez tous les tissus extériorisés.
10. Effectuez des sutures continues pour fermer les muscles abdominaux internes avec des sutures à aiguille de coupe inversée résorbables vicryl 5-0.
11. Effectuez des sutures interrompues pour fermer la peau abdominale externe avec des sutures à aiguille de coupe inversée non résorbables en monofilament de nylon 4-0. note: Des agrafes stérilisées de 9 mm peuvent également être utilisées pour fermer la peau abdominale externe. Cependant, contrairement aux sutures, elles interfèrent avec tout signal d’imagerie tumorale bioluminescent et fluorescent ultérieur.
12. Nettoyez tous les outils avec des lingettes stériles à l'éthanol (ouvertes par l'assistant du chirurgien) et placez-les dans un stérilisateur à billes de verre pendant 30 s. Laissez sécher les outils avant de les utiliser sur la souris suivante.
13. Rincer la seringue et l'aiguille dans une solution saline stérile (ouverte par l'assistant du chirurgien) pour éviter le colmatage par les restes de matrigel.
    note: Un assistant chirurgien doit être présent pour toutes les opérations, effectuant toute la préparation préopératoire non stérile des souris et les soins postopératoires des souris, ainsi que le mélange de la solution de matrigel Myc-CaP avant les injections. Pour minimiser le temps, comme chaque procédure de souris intraprostatique nécessitera 20 à 30 minutes, l’assistant chirurgien peut commencer à préparer la souris suivante pendant que le chirurgien suture la souris actuelle.

3. Soins postopératoires de la souris

1. Administrer 1 mg/kg de l’analgésique méloxicam s.c. immédiatement, 24 h et 48 h après la chirurgie.
2. Laissez les souris se rétablir dans une cage sans litière placée à mi-chemin sur un coussin chauffant. Surveillez les souris pendant au moins 30 minutes après l’opération jusqu’à ce qu’elles retrouvent une mobilité et une activité normales, après quoi placez-les dans une cage propre avec de la nourriture sur le sol de la cage.
3. Surveillez davantage les souris quotidiennement pour une bonne cicatrisation des plaies, le poids corporel, le toilettage et la marche après la chirurgie. Séparez les souris dans des cages individuelles sur toute preuve de combat.
4. Retirez toutes les sutures restantes dans les 14 jours suivant la chirurgie.

Graphique 1 : Lobe antérieur de la prostate, drainage des ganglions lymphatiques et technique représentative pour les injections de cellules intra-prostatiques. Images du lobe antérieur droit de la prostate (A) (noir, *), de la vésicule séminale droite attachée (blanche), du testicule droit et du coussinet adipeux (vert) et de la vessie (jaune), (B) des ganglions lymphatiques para-aortiques bilatéraux drainant la prostate (orange), (C) des ciseaux de micro-dissection, des pinces Graefe, des pinces à tissu Graefe, un porte-aiguille avec des coupe-sutures et une seringue de 50 μL avec une aiguille de calibre 28 (de gauche à droite), (D) incisions de la ligne médiane, (E) extériorisation de la vésicule séminale et du lobe antérieur de la prostate, (F) injection intra-prostatique et (G) engorgement du lobe antérieur de la prostate.