Génération de cellules cancéreuses de la prostate chimiorésistantes : une procédure pour obtenir des cellules cancéreuses résistantes aux médicaments in vitro

Dans cet article

Résumé

Source : Mohr, L. et al. Génération de modèles de cellules cancéreuses de la prostate résistantes à l’agent anti-mitotique docétaxel. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo décrit un protocole permettant de générer des modèles cellulaires résistants aux taxanes du cancer de la prostate. Ces modèles peuvent aider à étudier les voies impliquées dans la progression de la résistance au docétaxel chez les patients atteints de cancer de la prostate.

Protocole

1. Génération de cellules cancéreuses de la prostate résistantes au docétaxel

REMARQUE : Effectuer des traitements cellulaires à l’aide de la solution mère de Docétaxel utilisée pour la détermination de la concentration de médicament CI50 (préparer suffisamment de stock à l’avance pour une utilisation expérimentale). Les cellules parentales doivent être cultivées en parallèle dans un petit flacon tout au long de la procédure et exposées au véhicule (DMSO) dans des volumes correspondants imitant les quantités utilisées dans les flacons traités au Docétaxel.

Déposer les cellules DU145 ou 22Rv1 dans^{des 2} flacons de 150 cm contenant 20 mL de milieu (3,5 x 10⁶ cellules par ballon pour DU145 et 6,5 x 10⁶ cellules par ballon pour le 22Rv1). L’utilisation de 10 à 20 flacons de cellules est recommandée pour avoir suffisamment de cellules à la fin du protocole.
Après 24 h, lorsque les cellules sont à environ 70-80 % de confluence (Figure 1B, avant Docétaxel), ajouter le Docétaxel à la concentration IC50 (5 nM pour les cellules décrites dans ce protocole).
Après 72 h, aspirer un milieu contenant du médicament et ajouter un milieu frais sans docétaxel (figure 1B, 72 h après le docétaxel). Changez de support tous les 3-4 jours. Dans un délai d’environ 1 à 2 semaines, les clones résistants apparaîtront visibles au microscope (figure 1B, 7 et 14 jours après le docétaxel).
Aspirez le milieu, lavez soigneusement les cellules avec 15 mL de PBS et incubez avec 4 mL de trypsine-EDTA à 0,05 % pendant 3 à 5 min à 37 °C pour détacher les cellules de la surface du ballon.
Remettre en suspension les cellules trypsinisées du ballon à l’aide de 8 mL de milieu frais. Cellules de pool de tous les flacons traités. Cellules à granulés par centrifugation (300 x g, 3 min, RT).
Retirer le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 20 mL de milieu frais et déposer les cellules dans^{des flacons de 2 de 150} cm (3,5 x 10⁶ cellules par fiole pour l’UD145 et 6,5 x 10⁶ alvéoles par fiole pour le 22Rv1).
Après 24 heures, lorsque les cellules sont à environ 70-80 % de confluence, ajoutez à nouveau 5 nM de docétaxel (concentration initiale de CI50).
Répétez les étapes 1.3 à 1.6 le jour 3.
Après 24 h, lorsque les cellules sont à environ 70-80 % de confluence, traitez-les avec une concentration de docétaxel 2X IC50 (10 nM pour les cellules décrites dans ce protocole).
Répétez les étapes 1.3 à 1.8, après une augmentation de dose des concentrations de docétaxel (25 nM, 50 nM, 100 nM et 250 nM), pour générer une population stable de cellules se développant dans les flacons sous la concentration finale la plus élevée. Pour les concentrations plus élevées, le protocole d’escalade de dose peut être mis en œuvre jusqu’à 6 mois jusqu’à ce que la concentration de 1 000 nM soit atteinte (figure 2A).

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Résultats

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Figure 1 : Génération de systèmes modèles de cellules cancéreuses de la prostate résistants au docétaxel.(A) Schéma illustrant la détermination du docétaxel IC50 dans les lignées cellulaires parentales de cancer de la prostate DU145 et 22Rv1 (étape 1 du protocole). Les pourcentages attendus de viabilité cellulaire et les concentrations croissantes de Docétaxel nécessaires sont...