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1. Caractérisation fonctionnelle de la résistance acquise au docétaxel par essai de formation de colonies
REMARQUE : Dans ce protocole, la chimiorésistance a été évaluée à l’aide de tests de formation de colonies. D'autres méthodes utilisées pour évaluer la viabilité cellulaire (c.-à-d. les tests MTS) peuvent être utilisées en fonction des préférences des chercheurs.
- Plaquez 2 000 cellules (DU145 ou 22Rv1, parentales et résistantes au docétaxel) par puits dans des plaques à 6 puits, en utilisant 2 mL de milieu par puits.
- Après 24 h, ajouter des concentrations croissantes de Docétaxel (cellules parentales : 0,25, 0,5, 1, 2,5 et 5 nM ; Cellules DR : 50, 125, 250, 500 et 1 000 nM). Pour les lignées cellulaires DU145 et 22Rv1. Ajouter du DMSO uniquement à un puits en tant que témoin au même volume que celui utilisé pour la dose la plus élevée de Docétaxel.
- Après 72 h, aspirez le milieu contenant le médicament et ajoutez-y un milieu frais sans Docétaxel.
- Incuber les plaques pendant 1 à 2 semaines jusqu’à ce que les colonies soient visibles au microscope.
- Pour colorer les colonies, lavez-les délicatement avec 2-3 mL de PBS et incubez avec 2-3 mL de solution de violet cristallin (0,1 % p/v dans 10 % de formol) pendant 20 min à l’intérieur de la hotte de culture tissulaire ou d’une hotte.
- Enlever la solution tachante, laver les plaques avec 2-3 mL de H2O, retirer H2O et sécher les plaques à l’air.
- Analysez le résultat en visualisant les puits et en comptant manuellement les colonies à l’aide d’un marqueur (pour éviter de compter deux fois les mêmes colonies) et représentez le pourcentage de viabilité cellulaire dans un graphique. Prenez des images numériques des plaques pour la représentation de figures (Figure 1A).
