1. Préparation des cellules pour l’imagerie en direct
- Cultivez des cellules CWR22Rv1 exprimant la chaîne légère 3 couplée à des protéines fluorescentes vertes (LC3-GFP) dans des milieux de culture RPMI contenant 10 % de FBS et 1 % d’antibiotiques sur des boîtes de culture à fond de verre recouvertes de poly-D-lysine de 35 mm. Les cellules doivent être plaquées à une densité suffisante pour faciliter une prolifération rapide, mais pas au point que les cellules soient envahies par la végétation et agglutinées au moment de l’imagerie.
- Traiter des échantillons cellulaires sélectionnés avec une DJA (0,3 μg/mL) dans du PBS.
- Environ 1 heure avant l’imagerie, diluer 1,5 μl de LysoTracker Red DND-99 (Invitrogen, CA) avec 20 mL de RPMI contenant 10 % de FBS et 1 % d’antibiotiques. Utilisez des solutions contenant de la DJA pour les échantillons sélectionnés. Réchauffez tous les milieux à 37 °C avant de les ajouter dans la boîte de culture.
- Incuber des cellules avec RPMI contenant LysoTracker Red DND-99 pendant 15 à 45 min à 37 °C.
- Environ 30 minutes avant l’imagerie, allumez l’enceinte environnementale de la station météo et laissez-la s’équilibrer à 37 °C et 5 % de CO2 (avec de l’air humidifié).
- Lavez les cellules avec du PBS et remplacez le milieu par un RPMI standard contenant seulement 10 % de FBS et 1 % d’antibiotiques. Ajouter la DJA aux échantillons comme indiqué.
- Montez les boîtes de culture à fond de verre de 35 mm dans un adaptateur personnalisé (Applied Precision, Inc., WA) et placez-les sur la platine du microscope. Utilisez de l’huile d’immersion (indice de réfraction 1,520) sur l’objectif 60X 1,42 NA et positionnez la boîte de culture montée sur la platine.
2. Microscopie à super-résolution, à éclairage structuré (OMX)
REMARQUE : Le protocole de cette section s’applique à l’utilisation du microscope à éclairage structuré OMX (Applied Precision, WA).
- Allumez l’alimentation principale et les lasers souhaités (410 nm, 488 nm et/ou 532 nm). Attendez 20 min pour que les lasers soient stabilisés thermiquement.
- Ajoutez de l’huile d’immersion (indice de réfraction 1,516 pour les échantillons fixes à RT) sur l’objectif 60X 1,42 NA. Si des bulles sont observées dans la gouttelette d’huile, nettoyez l’objectif et ajoutez à nouveau de l’huile.
- Placez la lame d’échantillon sur la platine et, si nécessaire, laissez 10 minutes les cellules se déposer sur la lamelle.
- Initialisez le programme d’acquisition. Utilisez un éclairage à fluorescence pour ajuster la mise au point jusqu’à ce qu’un contour net de la cellule soit visible.
note: Des précautions doivent être prises en tout temps pour minimiser l’exposition des cellules à l’excitation de la fluorescence, jusqu’à l’acquisition réelle de l’image.
- Un balayage en mosaïque en spirale peut être acquis pour prévisualiser de plus grandes zones de l’échantillon afin de sélectionner des cellules ou des régions d’intérêt. Il est recommandé d’utiliser des temps d’exposition courts (1-10 ms) et une faible puissance d’excitation (0,1-1 % de transmission) lors du balayage de l’échantillon ou de la recherche de cibles.
- Identifier les autophagosomes par fluorescence GFP-LC3. Identifiez les lysosomes par l’anti-LAMP (protéine membranaire associée aux lysosomes) Alexa Fluor 555 et les noyaux cellulaires à l’aide de DAPI (échantillons fixes).
- Choisissez les conditions expérimentales, notamment la longueur d’onde d’excitation, la zone de l’image (par exemple, 512 x 512), l’épaisseur de la pile, le temps d’exposition et le pourcentage de transmission laser. Pour les images super-résolues, assurez-vous que l’option d’éclairage structuré est activée. Pour la microscopie à déconvolution sur l’OMX, sélectionnez l’option d’éclairage conventionnel.
- Pour obtenir les meilleurs résultats de reconstruction, sélectionnez des conditions expérimentales telles que le nombre maximal d’intensité soit compris entre 10 000 et 15 000 lors de l’acquisition. Si le photoblanchiment est un problème, on peut utiliser des images à une exposition plus faible (entre 5 000 et 10 000). Idéalement, les comptes ne devraient pas diminuer de plus d’un facteur deux pendant toute l’acquisition, et les diminutions de plus d’un facteur quatre devraient être évitées. Si nécessaire, réduisez l’épaisseur de la pile pour assurer un comptage d’intensité soutenu. L’appareil photo sature à 64 000 points, donc l’intensité maximale ne devrait jamais dépasser cela. Pour de bons échantillons, nous avons trouvé que les conditions expérimentales étaient de 10 ~ 50 ms de temps d’exposition avec une transmission laser de 1 %. Les échantillons lumineux et photostables qui peuvent être imagés à plusieurs reprises sont préférés. Une coloration stable est nécessaire pour les images en accéléré et super-résolues.
- Pour réduire le bruit, une vitesse de lecture de 95 MHz (option vitesse moyenne) et un temps d’acquisition de 2 ms ou plus sont recommandés. Une augmentation des artefacts est obtenue dans l’image reconstruite lorsque l’échantillon se déplace pendant l’acquisition. En raison de cet effet, de courtes expositions sont recommandées pour les cellules non adhérentes ou à mouvement rapide.
- L’imagerie multicanal peut être réalisée simultanément ou séquentiellement. Le mode séquentiel produit moins de diaphonie et est donc recommandé.
- Pour réduire le photoblanchiment, il est généralement recommandé d’imager d’abord avec des longueurs d’onde d’excitation plus longues (532 nm, 488 nm, puis 410 nm). Cependant, pour les résultats expérimentaux présentés à la figure 1, cet ordre a été inversé (c’est-à-dire 48 nm, 532 nm et 410 nm) en raison de la photostabilité de cet échantillon particulier.
- Réglez la limite supérieure/inférieure de la pile Z en déplaçant la platine du microscope jusqu’à ce que le haut/le bas des cellules soit légèrement flou. La distance souhaitée entre chaque image doit être maintenue constante à 0,125 μm pour l’imagerie en super-résolution, car le logiciel de reconstruction prend cette valeur par défaut.
- Reconstruisez des piles d’images à l’aide de SoftWorX (Applied Precision, WA) et analysez-les à l’aide de VoloCITY 6.0 (Perkin Elmer, MA).
