Extraction de protéines et protéolyse : une méthode pour obtenir des protéines à partir d’échantillons de tissus tumoraux de la prostate et leur digestion enzymatique en peptides

Résumé

Source : Cheng, L. C. et al. Enrichissement en phosphopeptide couplé à une spectrométrie de masse quantitative sans marquage pour étudier le phosphoprotéome dans le cancer de la prostate. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo décrit la technique d’extraction et de digestion des protéines pour obtenir des peptides à partir de tissu tumoral de la prostate. Ces peptides, après une analyse plus approfondie, peuvent aider à identifier de nouvelles cibles pour l’oncothérapie.

Protocole

1. Extraction des protéines

1. Préparez le tampon de lyse (tableau 1). (Le volume dépend du nombre d’échantillons à récolter.)
2. Prélèvement de tissus
   1. Pesez la tumeur et ajoutez 2 ml de tampon de lyse glacé pour 100 mg de tissu dans un tube à essai de culture. (En règle générale, 50 à 150 mg de poids humide de tissu sont nécessaires.)
3. Homogénéiser le lysat à l’aide d’un homogénéisateur à main ou de paillasse (impulsion 2x pendant 15 s). Nettoyez l’homogénéisateur avant le premier échantillon et entre les échantillons en utilisant successivement de l’eau de Javel à 10 %, de l’éthanol à 70 % et de l’eau déminéralisée.
4. Pour réduire et alkyler, chauffer les échantillons homogénéisés à 95 °C pendant 5 min. Ensuite, refroidissez-les sur de la glace pendant 15 min. Sur glace, soniquer le lysat 3x (c.-à-d. pulser pendant 30 s avec des pauses de 60 s entre les impulsions). L’échantillon ne doit pas être visqueux ou grumeleux à ce stade. Chauffer le lysat à 95 °C pendant 5 min.
5. Centrifuger le lysat dans le même tube de sonication à l’aide d’un rotor à godets oscillants à 3 500 x g à 15 °C pendant 15 min. Recueillir le surnageant et jeter la pastille.
6. Déterminez la concentration en protéines en effectuant un test de Bradford. Si nécessaire, diluer le lysat à 5 mg/mL avec un tampon de lyse. Conservez-le à -20 °C
   REMARQUE : L’expérience peut être interrompue ici. Congelez les échantillons à -80 °C et utilisez-les pour une analyse plus approfondie.

2. Digestion du lysat

1. Diluez l’échantillon 12 fois en utilisant 100 mM de Tris (pH = 8,5) pour réduire la quantité de guanidinium. Diluez tous les échantillons au même volume pour minimiser les effets d’une digestion inégale. Conservez 12,5 μg de lysat non digéré pour le confirmer sur un gel coloré à la Coomassie.
2. Pour 5 mg de protéines, ajoutez 10 μg de Lysyl Endopeptidase (Lys-C) et incubez-le à température ambiante pendant 5 à 6 h. Ajustez le pH à 8,0 en ajoutant 1 M de Tris non titré (pH ~11).
3. Préparez 1 mg/mL de trypsine traitée à la L-1-tosylamido-2-phényléthylchlorométhylcétone (TPCK) dans 1 mM de HCl (avec 20 mM de CaCl₂). Ajoutez la trypsine à un rapport trypsine :protéines de 1:100 et incubez-la à 37 °C pendant 3 h.
4. Ajoutez la même quantité de trypsine fraîche qu’à l’étape 2.3. Incuber à 37 °C pendant la nuit.
5. Économisez 12,5 μg de lysat digéré pour confirmer la digestion complète sur un gel coloré à la Coomassie.

3. Extraction en phase inverse

1. Enregistrez le volume de lysat. Filtrez l’échantillon à l’aide d’un filtre de coupure de 15 mL et de 10 kDa. Centrifuger l’échantillon à 3 500 x g à l’aide du rotor à godets pivotants (ou 3 500 x g dans un rotor à angle fixe) à 15 °C jusqu’à ce que le volume de rétentat soit inférieur à 250 μL (cela prend environ 45 à 60 min). Recueillir le flux et jeter le rétentat.

Tableau 1 : Tampons et solutions.Ce tableau montre la composition des tampons et des solutions utilisés dans ce protocole.

tampon	volume	composition
6 M tampon de lyse au chlorure de guanidinium	50 ml	6 M de chlorure de guanidinium, 100 mM de tris pH 8,5, 10 mM de tris (2-carboxyéthyl) phosphine, 40 mM de chloroacétamide, 2 mM d’orthovanadate de sodium, 2,5 mM de pyrophosphate de sodium, 1 mM de β-glycérophosphate, 500 mg de n-octyl-glycoside, eau ultra-pure au volume
100 mM de pyrophosphate de sodium	50 ml	2,23 g de pyrophosphate de sodium décahydraté, eau ultra-pure au volume
1M β-glycérophosphate	50 ml	15,31 g de β-glycérophosphate, eau ultra-pure au volume
5 % d’acide trifluoroacétique	20 mL	Ajouter 1 mL d’acide trifluoroacétique à 100 % dans 19 mL d’eau ultra-pure
0,1 % d’acide trifluoroacétique	250 ml	Ajouter 5 ml d’acide trifluoroacétique à 5 % à 245 ml d’eau ultra-pure
Tampon d’élution pY	250 ml	0,1 % d’acide trifluoroacétique, 40 % d’acétonitrile, eau ultra-pure au volume
Tampon d’élution pST	250 ml	0,1 % d’acide trifluoroacétique, 50 % d’acétonitrile, eau ultra-pure au volume
Tampon de liaison IP	200 ml	50 mM tris pH 7,4, 50 mM chlorure de sodium, eau ultra-pure au volume
25 mM de bicarbonate d’ammonium, pH 7,5	10 ml	Dissoudre 19,7 mg dans 10 mL d’eau stérile ultra-pure, pH à 7,5 avec de l’acide chlorhydrique 1 N (~10-15 μL/10 ml de solution), faire fraiser
Tampon phosphate 1M, pH 7	1 000 ml	423 mL de dihydrogénophosphate de sodium 1 M, 577 mL d’hydrogénophosphate de sodium 1 M
Tampon d’équilibrage	14 ml	6,3 ml d’acétonitrile, 280 μL d’acide trifluoroacétique à 5 %, 1740 μL d’acide lactique, 5,68 ml d’eau ultra-pure
Tampon de rinçage	20 mL	9 mL d’acétonitrile, 400 μL d’acide trifluoroacétique à 5 %, 10,6 mL d’eau ultra-pure
Solution de spectrométrie de masse	10 ml	500 μL d’acétonitrile, 200 μL d’acide trifluoroacétique à 5 %, 9,3 mL d’eau ultra-pure
Zone tampon A	250 ml	5 mM de phosphate monopotassique (pH 2,65), 30 % d’acétonitrile, 5 mM de chlorure de potassium, eau ultra-pure au volume
Tampon B	250 ml	5 mM de phosphate monopotassique (pH 2,65), 30 % d’acétonitrile, 350 mM de chlorure de potassium, eau ultra-pure au volume
Hydroxyde d’ammonium à 0,9 %	10 ml	300 μL d’hydroxyde d’ammonium à 29,42 %, 9,7 mL d’eau ultra-pure

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Congélateur à ultra-basse température	Panasonic	MDF-U76V
Congélateur -20 °C	VWR	SCPMF-2020
Godet à rotor pivotant	ThermoFisher Scientific	75004377
Rotateur bout à bout	ThermoFisher Scientific	Réf. 415110Q
Tubes Eppendorf à faible liaison aux protéines	Eppendorf	22431081
Trypsine, traitée TPCK	Produits biochimiques de Worthington	LS003740
Lysyl endopeptidase	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	Référence 125-05061
Eau MilliQ			eau déminéralisée utilisée pour préparer toutes les solutions et tampons
Démantailleurs sonique	Fisher Scientific	FB-120	sonicateur
Système Polytron PT	Kinematica AG	PT 10-35 GT	Homogénéisateur